IMVIC与硫化氢试验

IMVIC与硫化氢试验

　　一、目的要求

　　了解IMVIC与硫化氢反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义。

　　二、基本原理

　　IMVIC是吲哚试验（indol test）、甲基红试验（methylred test）、伏-普试验（Voges-Prokauer test，V．P．试验） 和柠檬酸盐试验（citrate test）的缩写。这四个试验主要用来鉴别大肠杆菌与产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes），而且主要是用于水的细菌学检查，因为大肠杆菌虽非致病菌，但在饮水中若大肠杆菌超过一定数量则表示受粪便污染，而产气肠杆菌则广泛存在于自然界中，因此，检查水时要将二者区分开来。

　　硫化氢试验也是检查肠道杆菌的生化试验。

　　吲哚试验。有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，就会形成红色的玫瑰吲哚。

　　色氨酸水解反应：

　　吲哚与对二甲基氨基苯甲醛反应：

　　吲哚 对二甲基氨基苯甲醛

　　大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌阴性。

　　甲基红试验。某些细菌在糖代谢过程中，将培养基中的糖先分解为丙酮酸，丙酮酸再分解为甲酸、乙酸、乳酸等，因而使培养基变酸，用甲基红指示剂[pH4．2（红色）-6．3（黄色）]，可使培养基由原来的桔黄色变为红色，即甲基红阳性反应。大肠杆菌为阳性反应，产气肠杆菌为阴性反应。

　　伏-普试验。某些细菌可利用葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进行缩合，脱羧变成乙酰甲基甲醇，此物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即伏-普反应阳性，没有红色化合物产生则为阴性。其反应过程如下：

　　产气肠杆菌伏-普反应阳性，大肠杆菌伏-普反应阴性。

　　柠檬酸盐试验。有些细菌能利用柠檬酸钠作为碳源，例如产气肠杆菌；而另一些细菌不能利用柠檬酸钠，例如大肠杆菌。细菌在分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后，产生碱性化合物，使培养基的pH升高，在有1%溴麝香草酚蓝指示剂的情况下，培养基由绿色变为深蓝色。溴麝香草酚蓝的指示范围为：pH小于6．0时呈黄色，pH在6．0-7．6时为绿色，pH大于7．6时呈蓝色。

　　硫化氢试验。有些细菌能分解含硫的有机物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等产生硫化氢，硫化氢遇培养基中的铅盐或铁盐等，则形成黑色的硫化铅或硫化铁的沉淀物，从而可确定硫化氢的产生。

　　以半胱氨酸为例，其化学反应过程如下：

CH2 SHCHNH2 COOH H2 O→

CH3 COCOOH H2 S↑ NH3 ↑

H2 S Pb（CH3 COO）2 →PbS↓ 2CH3 COOH

　　（黑色）

　　大肠杆菌为阴性，产气肠杆菌为阳性。

　　三、器材

　　大肠杆菌，产气肠杆菌；

　　蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，柠檬酸盐斜面培养基，醋酸铅培养基；

　　甲基红试剂，40％KOH，5％α-萘酚，乙醚，吲哚试剂等。

　　四、操作步骤

　　1．接种与培养

　　(1)用接种针将大肠杆菌、产气肠杆菌分别穿刺接入2支醋酸铅培养基中，置37℃温室培养48小时。

　　(2)将上述二菌分别接种于2支蛋白胨水培养基中（做吲哚试验），置37℃温室中培养2天。

　　(3)将上述二菌分别接种于2支葡萄糖蛋白胨水培养基中（做甲基红试验与伏-普试验），置37℃温室培养2天。

　　(4)将上述二菌分别接种入2支柠檬酸盐斜面培养基中。置37℃温室培养2天。

　　2．观察结果

　　(1)培养48小时后观察硫化氢产生情况。

　　(2)吲哚试验于培养48小时后的蛋白胨水培养物内加3—4滴乙醚，摇动数次，静置1—3分钟，待乙醚上升后，沿管壁徐徐加入2滴吲哚试剂，在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。

　　(3)甲基红试验培养48小时后，将葡萄糖蛋白胨水培养物分为两小管（其中一管留做伏-普试验），在一管内加甲基红试剂2滴，培养基变红色者为阳性，变黄色者为阴性。

　　(4)伏-普试验在上述留下的一小试管培养物中加入40%KOH5—10滴，然后再加入等量的5%α-萘酚溶液，用力振荡，再放入37℃温箱中保温15—30分钟，以加快反应速度。若培养物呈现红色者，为伏-普反应阳性。

　　(5)柠檬酸盐试验培养48小时后观察柠檬酸盐培养基上有无细菌生长和是否变色。蓝色为阳性，绿色为阴性。

　　五、实验报告

　　1．结果

　　 将实验结果填入下表。“ ”表示阳性反应；“-”表示阴性反应。

　　2．思考题

　　(1)微生物生化反应的意义何在？

　　(2)甲基红试验和伏-普试验的最初作用物以及最终产物有何异同点？为什么会出现最终产物的不同？