植物真菌病害抗性鉴定

真菌病害是作物产量损失的主要原因之一，作物病害的80%由病原真菌所引起。迄今，对作物真菌病害的控制，一是选育并采用抗性品种，二是使用化学杀菌剂，三是采取预防措施，如轮作、避免受侵染土壤和带病原植物材料的传播等。

然而，化学杀菌剂成本较高，且最终导致病原菌的抗药性，其残毒还引起环境污染等问题。综合采用有性杂交及现代生物技术选育并推广抗病品种，这是所有病害防治策略中最经济有效的方法。

特别是重组DNA技术的创立和发展，已可将动物、植物、微生物的基因相互转移，突破了物种之间难以杂交的天然屏障，开辟了植物育种的新途径。近年来，一些科学家致力于利用基因工程方法，如基因转移技术，培育抗真菌病害的作物品种。该领域的研究，有的已取得显著的成果，或出现很好的苗头，具有诱人的应用前景。

本实验重点学习小麦条锈病接种和鉴定的方法。小麦条锈病的接种方法很多，有涂抹法、喷粉法、喷雾法、注射法等等。又因接种鉴定的时期不同，分为幼苗鉴定和成株鉴定。

一、试材及用具

小麦盆栽幼苗，菌种，接种针，毛玻璃，小喷雾器、喷粉器，滴瓶，保湿桶，铅笔，指形管，酒精，塑料薄膜（或玻璃），滑石粉，注射器等。

二、内容说明

抗病性鉴定（evaluation of disease resistance ）是抗病育种的重要基础，从抗原筛选、后代选择、直到品种推广的全过程都离不开抗病性鉴定。狭义的抗病性鉴定是评价寄主品种、品系或种质对特定病害抵抗或感染程度，广义的抗病性鉴定还应包括病原物的致病性评价。鉴定方法包括自然鉴定、接种鉴定、田间成株鉴定室内苗期鉴定、离体鉴定及间接鉴定等，在实际工作中则需根据植物、病害种类，目的要求和设备条件而定。下面分别介绍如下：

1．田间自然鉴定 自然发病条件下的田间鉴定是鉴定抗病性的最基本方法，尤其是在各种病害的常发区，进行多年、多点的联合鉴定是一种有效方法。它能对育种材料或品种的抗性进行最全面、严格的考验。田间鉴定的方法因植物种类而异，大田作物的田间鉴定一般要进行人工接种，接种方法又因病菌而异。

对棉花黄萎病等土传病害，除在重病地设立自然病圃外，在非病地设立人工病圃时，必须用事先培养的菌种，在播种或施肥时一起施入，以诱发病害。对于小麦锈病、玉米大斑病及稻瘟病等气传病害，可分别用涂抹、喷雾、及注射等方法进行接种，以使具有抗接触、抗侵入等抗病机制的品种也得以发病。

病圃的设置与利用是进行抗病性鉴定的基本条件，没有重而均匀的发病条件就难以对植物品种资源的抗病性做出可靠的鉴定。

按照病圃发生病害种类的不同，病圃可分为单一病圃和多种病害混生病圃。单一病圃的优点是可以避免多种病害的干扰，有利于鉴定不同品种资源对不同病害的抗病性，同时也是选育单抗品种的必要条件；而多种病害混生病圃的优点是可在较短的时间内选育或鉴定具兼抗或多抗性的材料。

对于树体大、多年生的果树及观赏植物进行田间鉴定，可将待鉴定的材料按一定的株行距定植于大田，全年不使用任何杀菌药，并于发病盛期，每份材料调查100～300个果实或叶片的发病程度，计算病情指数。它的优点是能较全面准确地反应被鉴定材料的抗病性，结果可靠性较强，操作方便。缺点是占用较多的土地，费用较高。贺普超等（1995）、H.Kemp等（1999）及V.Ognjanov等（1999）等分别采用上述方法对葡萄及苹果的抗病性进行了研究。

2．温室或田间接种鉴定 这种方法是将病原菌孢子或病毒直接接种到温室或田间植株的叶片、果实或根上，它适合对所有植物进行抗病性鉴定。由于抗病现象是寄主、病原物及环境条件三者共同作用的结果，因此，这种鉴定结果也能真实地反映被鉴定材料的抗病性，可靠性强。

接种鉴定的技术规程包括育苗、接种体的制备（病菌的分离、保存与孢子诱发）及接种三个环节，接种的方法有点滴法、喷雾法、浸根法、摩擦法及注射法等，叶片及果实接种，适宜选用点滴法或喷雾法，而土传病菌，如黄瓜枯萎病可采用孢子悬浮液浸根法进行接种。接种材料的发育程度及接种孢子浓度（选择压）等因素都会影响鉴定的效果，因此这些因素要通过试验，以便确立最佳方案。

3．离体接种鉴定 从植物植株上取下子叶、叶片或果实进行离体接种鉴定，可鉴定那些以组织、细胞或分子水平的抗病机制为主的病害，如马铃薯晚疫病、小麦白粉病及烟草黑胫病等。离体鉴定具有操作简便、鉴定结果可靠等优点，可同时分别鉴定同一材料对不同病原菌的抗性，而不影响幼苗正常生长发育和开花结实。

鉴定方法不仅因植物、病菌种类而异，而且抗病性分级标准也因作物、病原菌的种类不同而存在很大的差别，例如白菜霜霉病的病情分级标准是：

病情指数反应了病害的普遍率和严重程度，指数越大，说明病情越严重，寄主的抗病性越差；指数越小，说明病情越轻，寄主的抗病性越强。

根据病情指数，可将植物对一些病害的抗病性进行分类，其中白菜霜霉病等病害适用下列标准：

免疫（I）：病情指数0

高抗（HR）：病情指数0.01～15.00

抗病（R）：病情指数15.00～35.00

中抗（MR）：病情指数35.00～55.00

感病（S）：病情指数55.00～75.00

高感（HS）：病情指数75.00～100.00

小麦锈病流行地区广，产量损失大，一般减产25～75%，在某些地区甚至是限制小麦生产的主要因素。选育和栽培抗锈品种是防治小麦锈病危害的最根本有效措施。因此，在小麦育种过程中，必须了解和掌握抗锈性鉴定的方法。

小麦锈病有条锈、叶锈、秆锈三种，由于地区间生态条件的差异，锈病发生的种类不同，而且危害的程度也各异。我国北方冬小麦区以条锈病为主，叶锈病、秆锈病次之；春麦区则以秆锈病为主。锈病的发生受到小麦材料的抗病能力、病原物的致病力和发病环境的影响，因此锈病在自然条件下，并非每年每地均严重发生。在进行抗病育种中，除在发病的麦田进行直接鉴定外，有时还必须在人工接种环境下，进行诱发鉴定。

三、方法步骤

（一）锈病病菌接种

1．幼苗接种 一般在温室内进行，于麦苗第一片叶子长达4～5cm时接种，等充分发病后再进行鉴定，这种方法的好处是可在较短的时间内测定大量材料对锈病的抗病性；便于鉴定不同小麦品种对不同锈病生理小种的抗病性；能防止当地未发现而外地已存在的新的生理小种向外传播。幼苗鉴定的接种方法有以下几种：

（1）涂抹法 此法主要用于繁殖少量菌种或接种少量鉴定材料时应用。在接种鉴定前10d左右，将待鉴定的小麦品种的种子，播种于直径为2.5～3寸左右的小花盆内。每盆播种2～3个品种，其中一个品种为易感病的诱发品种，以用作对照。各品种要相互隔开，插上木签，注明品种名称及播种日期等。在开始接种前，先从用以繁殖锈病孢子的麦苗上，采集病菌孢子置放于小指形管中（注明菌种生理小种号及采集日期），然后从指形管中取出少许锈菌孢子放在洁净的毛玻璃上，用滴管加入少量水，用接种针将锈菌孢子与水拌匀备用。另外用洁净的手指沾清水或0.1%吐温（tween）水溶液将麦苗的叶片摩擦数次，去掉叶片表面的蜡质和茸毛，以利于菌液吸附于叶面上。用消毒过的接种针沾上调制好的孢子液，涂抹于麦叶表面进行接种。一般将条、叶锈的孢子接种于叶片的正面，而秆锈病则接种于叶片背面为好。然后记录并在木签上注明接种日期及所用菌种。接种后把麦苗随即放入保湿桶中（即用一铁皮桶，其内盛水，保持99～100%湿度），再用喷雾器喷降水雾，令麦苗和保湿桶的内壁沾满雾滴，喷雾不能过量，以防冲掉已接种的锈病孢子。喷雾后，马上盖严塑料薄膜或玻璃，把保湿桶放置在适当的温度条件下。经24h左右，再将麦苗取出，移至阳光充分的温室内，约经二周后麦苗即可发病，此时即可鉴定品种的抗病力。

麦苗接种后，保湿阶段要求的最适温度，条锈为9～13℃，叶锈为15～20℃，秆锈为18～22℃。自保湿桶中取出放入温室后平均温度最好分别控制在16～18℃（条锈），18～22℃（叶锈），21～24℃（秆锈）。光照时间每天应不少于12h，冬季光照不足，需每天增加一定时间的人工辅助光照。上述的温度和光照掌握的好坏是发病充分与否的关键。

在分别接种不同生理小种进行鉴定时，接种用的一切用具都要先行消毒，防止可能发生的污染，影响鉴定结果。

（2）喷粉法 小喷粉器经消毒、干燥后，加入适量的干燥滑石粉，再加入少量新采集的锈病孢子，混合均匀待用（滑石粉与孢子的比例约为20～30：1）。接种用的锈病孢子应事先去除混在其中的杂质，以防喷粉时造成喷粉器堵塞。开始接种前，先将已去除叶片蜡质的盆栽麦苗，放入保湿桶内，用喷雾器在麦苗上均匀喷上雾滴，随即用喷粉器将上述稀释的孢子粉均匀地喷洒到每盆麦苗的叶片上，再用喷雾器喷雾，使麦苗和保湿桶内壁都沾上水滴，掌握水滴不下滴为度。最后盖上塑料薄膜，保湿阶段和以后各项操作及注意事项同前述。

（3）喷雾法 用小型喷雾器将制备好的新鲜孢子悬浮液（在喷雾器内，加入要接种的锈菌孢子，先用少量清水湿润后，搅成糊状，再加入足量的水至淡桔黄色即可）喷在叶片已去蜡质的麦苗上，接种后将麦苗放于保湿桶内保湿，以后的操作及注意事项同前述。
喷粉法及喷雾法适于对大量材料的接种鉴定。

2．成株接种 成株接种多在田间进行，其方法是在待鉴定抗病力的品种或育种材料的四周播种高度感染锈病的品种作为锈病鉴定的诱发行。为了造成发病的环境，以得到可靠的鉴定结果，常需要在诱发行上每隔一定距离的麦苗上进行人工接种，以造成锈病的发病中心。用于接种的锈病孢子应是当地流行的优势小种，可以是一个小种，也可以是几个优势小种孢子混合。接种的方法如下：

（1）喷粉法 接种前，用手沾清水将叶片拂擦数下，以去掉叶片蜡质，然后用喷雾器喷上雾滴，用喷粉器将由滑石粉稀释好的孢子粉喷于麦苗上，再用喷雾器喷上水雾，随即用小花盆或塑料薄膜覆盖保湿，历时24h揭开。此法多用于麦苗起身前后。

（2）注射法 此法多用于麦苗有一定生长高度的拔节期。接种前，应配制好孢子悬浮液，配制方法同前，于显微镜400×视野中平均有10～20个锈菌孢子数为适宜浓度。一般在诱发行上每隔1m左右选取3～5个单茎分别注射接种。其方法是用注射器将孢子悬浮液从小麦心叶与其下的展开叶叶鞘相接处以下约1cm处注射，针头易向下倾斜刺入，但不要刺穿，挤压少量悬浮液，以见到心叶处冒出水珠为度。孢子一般悬浮于液面，所以孢子悬浮液必须随用随搅拌或震荡。田间接种注射最好在阴天的傍晚进行。如天气干旱，接种后在接种点上浇水1～2次，也可以在接种前或接种后适当灌水，以提高田间湿度，利于锈菌孢子萌发、侵染和发病。
除上述二种方法以外，还可以用喷雾法，即将配成的孢子悬浮液喷在诱发行上进行接种。接种后为了有利于锈病孢子萌发、侵染，也要进行保湿。

接种后，约二周后即可发病。但成株的抗病性鉴定一般在小麦乳熟期以后，锈病发展到高峰时进行，每个品种逐个进行调查记载。

（二）抗锈性鉴定

1．幼苗鉴定

衡量小麦品种对锈病的抗病和发病程度，常用到反应型（感染型）、严重度和普遍率三个指标。幼苗期鉴定一般考察其反应型。反应型是指植株受病菌侵染后的保卫性反应，可以用过敏性坏死的有无强弱，孢子堆能否形成，孢子堆的大小、多少等来判断。小麦品种对条锈菌的反应型可分为6级，分级标准如表5－1所示。

2．成株鉴定

（1）反应型：同幼苗鉴定。

（2）严重度：即病叶上着生孢子堆部分占整个叶片面积的百分率，用于表示病害发生的严重程度。从理论上讲，应将小区内的每一叶片都进行统计而后取平均值。但在实际工作中，往往因人力不足，而仅采用目测估计法。总体上目测评定叶片的发病情况，估计出发病的严重程度（严重率）。目前严重率分级标准尚不统一，但多数采用以下7级分级标准：

（3）普遍率：指病害发生的普遍程度，即发病叶片数占调查总叶片数的百分数率。

普遍率＝发病叶片数/调查叶片总数×100%

在实际工作中，一般也采用目测估计法进行观测。要求较精确鉴定时，可根据被鉴定材料小区面积的大小，随机选取30～60叶进行观察记载。