正常小鼠肾间质成纤维细胞的培养
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实验材料:
1. 肾组织:取自8周龄健康雌性小鼠;
2. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS,添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素,pH7.2;
3. 0.1%明胶:为生长基质成分,在取材前先用它包被培养瓶的生长面;
4. 消化液:0.1%胰蛋白酶溶液;
5. 培养液:DMEM培养液,补充20%的胎牛血清、成纤维细胞生长因子(α-FGF)2µg/ml、庆大霉素100µg/ml、青霉素100IU/ml、链霉素100µg/ml;
6. 用于细胞鉴定的抗体:抗细胞角蛋白(cytokeratin)抗体、抗角蛋白(keratin)抗体、抗波形蛋白(vimentin)抗体、抗结蛋白(des min)抗体、抗α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscular actin,α-SMA)抗体;
7. 眼科剪、眼科镊等无菌消毒手术器械;
8. 网筛:100目、150目;
9. 离心管(15ml、50ml);
实验方法:
1. 取材;
① 断颈处死小鼠,在无菌条件下迅速取出肾脏,用生理盐水冲洗干净,剥离肾被膜;
② 切取肾皮质,将皮质组织剪成2—3mm的细条。在100目不锈钢网筛上轻轻研磨,并用生理盐水冲洗,收集滤液。将滤液再用150目的网筛过滤,收集网筛上富含肾小管的间质碎片;
③ 在倒置显微镜下观察收集的间质碎片,其中应主要为肾小管节段。如果混有较多的肾小球,则须将收集到的间质碎片再放置到150目网筛上冲洗,直至肾小管纯度达98%以上后才进行下面的步骤;
④ 用培养液悬浮收集的肾小管节段;
2. 接种与培养;
① 将肾小管节段悬液加入已用明胶包被的培养瓶内。于37℃、5%CO2 培养箱中培养。每4—5d换液一次。
② 待细胞长满瓶壁后,用0.1%胰蛋白酶消化传代。每4—5d传代一次,通常连接传代至第三代时即可获得较纯的成纤维细胞。一般可传10代左右;