实验小窍门
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19569
对于经历了硕士. 博士以及博士后磨练的前辈们. 大家肯定都有自己的科研体会和实验技巧的窍门或者"绝活". 这些窍门有的可能是书本上学不到的。对于新入实验室的师弟师妹们来说. 听听师兄师姐们的实验心得可以使自己更快进入科研角色. 避免走很多弯路。
经验一
形态学方法
免疫组织化学
实验对象：冰冻切片
步骤
1. 室温下复温30 Min. 0. 01 M PBS清洗5 Min×3；
2. 加入配好的0. 3% Triton X100（30% Triton X100＋0. 01 MPBS 100 Ml）30 Min. 以增加细胞的通透性. 0. 01 MPBS清洗5 Min×3；
3. 5%小牛血清封闭1 h0. 01 MPBS清洗5 Min×3；
3. 加入用血清稀释液（牛血清白蛋白 1. 00 g＋0. 01 MPBS 100 Ml)稀释的一抗. 4 ℃存放24-48 h；吸去抗体. 0. 01 MPBS洗5 Min×3；
4. 加入配好的0. 3%的过氧化氢甲醇溶液（甲醇80 Ml＋0. 01 MKPBS 100 Ml＋30%过氧化氢）30 Min. 以消除内源性过氧化物酶的影响. 0. 01 MPBS清洗5 Min×3；
5. 加入0. 01 MPBS稀释的的二抗. 室温孵育2 h。0. 01 MKPBS洗5 Min×3；
6. 加入ABC复合物之类的抗体. 室温孵育2 h. 0. 01 MPBS洗5 Min×3；蒸馏水迅速冲三次；
7. 加入显色液. 进行免疫组织化学显色. 时间一般不超过30 Min. 可不时在显微镜下进行观察. 待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液. 用蒸馏水迅速冲三次后加入0. 01 MKPBS终止反应；
8. 梯度酒精脱水之后. 封片. 拍照。
细节将消除内源性过氧化物酶这一步放在后面. 能避免双氧水对目的蛋白的影响
经验二
（1）实验技术大类：
免疫测定与诊断技术
（2）具体实验技术名称：
ELISA
（3）实验对象：
肿瘤病人血清标本
（4）简要步骤:① 包被：用包被缓冲液将 MBP/OY-TES-1稀释至1. 0μ g/ Ml. 取100μl/孔包被酶标板. 4 ℃湿盒过夜。1×PBS-T洗板3次（室温静止30sec/次）. 甩去液体. 用纸吸干；
② 封闭：5%脱脂奶（200μl/孔）37 ℃封闭30 Min. 1×PBS-T洗板4次. 甩去液体. 用纸吸干；
③ 上血清：加入待检稀释血清（1:400）. 阳性对照和空白对照各100μl/孔. 37 ℃湿盒孵育1 h. 1×PBS-T洗板4次. 甩去液体. 用纸吸干；
④ 上二抗：加入Biotin-绵羊抗人I g g单克隆抗体（1:1000）. 37 ℃湿盒温育1 h. 1×PBS-T洗板4次. 甩去液体. 用纸吸干；
⑤ 上标记物：加入Avidin- hRP（1:1000）. 37 ℃湿盒温育30 Min. 1×PBS-T洗板4次. 甩去液体. 用纸吸干；
⑥ 显色：T MB避光显色15 Min. 加1N h2SO4终止反应；
⑦ 酶标仪OD450与OD630双波长读数。
（5）我的窍门或者心得体会：1. 我没用试剂盒做（尚未有商业化试剂盒开发）. 所以一切数据都要自己计算. 包括包被蛋白浓度. 一抗浓度. 二抗浓度. 计算时务必不能出错. 要不就会功亏一篑。
2. 用任何试剂前都要把试剂混匀. 因为蛋白是很容易沉淀的。
3. 用固定的几把移液器. 这样可以尽可能的较少误差。
4. 湿盒孵育前要先把湿盒放在37°进行温度平衡. 这样可以减少达到平衡的时间. 而且也可以避免符合试验温度的孵育时间不够。
5. 等板底的水珠挥发以后再读数. 要不会出现负值。
6. 实验时尽量少开口说话（因为大部分做的是蛋白的测定. 口水避免不了会使所测蛋白降解的啊. 呵呵）
经验三
1）实验技术大类：
动物建模
（2）具体实验技术名称：
早产儿视网膜病变动物模型建立
（3）实验对象：
C57BL/6J小鼠
（4）模型制作：高氧组幼鼠与哺乳母鼠一起置于密闭容器内. 氧气的流量控制在0. 5～1. 0 L/ Min. 使容器内氧气分压控制在75%±2%. 期间用测氧仪持续监测容器内的氧分压；每2 d打开氧箱更换垫料. 加食. 换水. 替换母鼠。在此高氧环境中饲养5 d. 5 d后即出生第12 d (P12) 返回正常空气环境中继续与母乳共同饲养。对照组幼鼠与哺乳母鼠始终在正常空气环境中饲养。
（5）我的窍门或者心得体会：OIR（氧诱导视网膜病变）小鼠模型是目前最常用的氧诱导视网膜病变模型。该动物模型不受动物性别的影响. 左右眼血管化区域和新生血管的严重程度具有较好的一致性. 避免了实验误差。建议采用75%O2浓度建立模型. 效果良好。
虽然有资料表明. 将小鼠持续5 d置于80%以上O2浓度的密闭氧箱内. 然后返回正常空气环境. 同样可以建立血管增殖性视网膜病变模型. 但在预实验中我们发现. 随着氧浓度的升高. 视网膜新生血管的发生率仅有轻微增加. 但母鼠的死亡率却明显增加。
另外在预实验中. 为了简化实验流程. 同时减少母鼠调换后母鼠食小鼠的现象. 我们曾试图将母鼠连续5 d置于75%O2浓度环境中饲养. 但发现母鼠多在第4～5 d或者出箱后因氧中毒肺水肿死亡。为此我们采用75%O2浓度. 每2 d对调母鼠同时更换水. 垫料. 食物. 这样基本可避免母鼠死亡. 同时获得基本一致的视网膜血管增生反应。
经验四1）实验技术大类：
动物建模
（2）具体实验技术名称：
早产儿视网膜病变动物模型建立
（3）实验对象：
C57BL/6J小鼠
（4）模型制作：高氧组幼鼠与哺乳母鼠一起置于密闭容器内. 氧气的流量控制在0. 5～1. 0 L/ Min. 使容器内氧气分压控制在75%±2%. 期间用测氧仪持续监测容器内的氧分压；每2 d打开氧箱更换垫料. 加食. 换水. 替换母鼠。在此高氧环境中饲养5 d. 5 d后即出生第12 d (P12) 返回正常空气环境中继续与母乳共同饲养。对照组幼鼠与哺乳母鼠始终在正常空气环境中饲养。
（5）我的窍门或者心得体会：OIR（氧诱导视网膜病变）小鼠模型是目前最常用的氧诱导视网膜病变模型。该动物模型不受动物性别的影响. 左右眼血管化区域和新生血管的严重程度具有较好的一致性. 避免了实验误差。建议采用75%O2浓度建立模型. 效果良好。
虽然有资料表明. 将小鼠持续5 d置于80%以上O2浓度的密闭氧箱内. 然后返回正常空气环境. 同样可以建立血管增殖性视网膜病变模型. 但在预实验中我们发现. 随着氧浓度的升高. 视网膜新生血管的发生率仅有轻微增加. 但母鼠的死亡率却明显增加。
另外在预实验中. 为了简化实验流程. 同时减少母鼠调换后母鼠食小鼠的现象. 我们曾试图将母鼠连续5 d置于75%O2浓度环境中饲养. 但发现母鼠多在第4～5 d或者出箱后因氧中毒肺水肿死亡。为此我们采用75%O2浓度. 每2 d对调母鼠同时更换水. 垫料. 食物. 这样基本可避免母鼠死亡. 同时获得基本一致的视网膜血管增生反应。
经验五
1）实验技术大类：
形态学
（2）具体实验技术名称：
视网膜铺片ADP酶染色
（3）实验对象：
C57BL/6J小鼠视网膜
（4）简要步骤：
①在解剖显微镜下沿角巩膜缘切开眼球. 娩出晶状体. 液态玻璃体自行流出. PBS清洗后段眼杯。
②将眼杯倒扣于平皿上. 以视神经为中心. 小心剥离视网膜与脉络膜。
③以后极为中心. 将视网膜放射状切开为6瓣。
④将取出的视网膜置于24孔板中染色。
（5）我的窍门或者心得体会：视网膜铺片ADP酶染色法并不是一个复杂的技术. 对大鼠来说很容易. 但对于C57BL/6J小鼠和昆明小鼠来说则很难. 尤其是出生几天的幼鼠. 因此需要掌握一定的方法. 注意一些操作中的细节. 才能较完整的分离出视网膜. 使铺开的视网膜平整. 染色后背景干净. 血管分布层次清晰. 动静脉易于辨认。
1固定时间 关于眼球的固定时间. 我认为多聚甲醛固定4～6小时为宜。固定时间过短（﹤4小时）及固定时间过长（过夜）都不利于视网膜的分离。视网膜会与巩膜粘连在一起. 分离时容易扯破. 且铺片时容易卷曲。
2 眼杯的分割 有资料介绍说. 以视盘为中心. 用眼科剪将眼杯剪为4～6瓣. 但我在操作过程中发现. 眼科剪刃较厚. 剪开视网膜时很容易由于挤压力使视网膜变形. 甚至破裂。有的资料虽然说到要以视盘为中心将视网膜放射状切开. 但没有具体描述其过程。
我的做法是：分离出视网膜后. 用有齿弯镊抵住视网膜后部. 使其呈半竖立位. 用手术刀片（或刮胡刀片）以视盘为中心放射状切开视网膜. 切完一刀然后慢慢转动一下视网膜. 直至切成4～6瓣。切开时可以距离视盘近些. 以减小各瓣之间的相互拉力. 同时可以防止各瓣内的毛细血管网在铺片过程中随其弧度而卷曲起来。或者以视盘为中心. 间隔等距离呈V字型切除一些视网膜组织. 同样可以达到较好的效果。
3 铺片 染色后将视网膜夹持到载玻片上. 如果卷曲重叠. 可以用注射器针头轻轻将各瓣挑起. 铺平. 同时挑除各瓣页上漂浮的毛细血管网. 然后用滤纸沿视网膜边缘吸干残留的液体. 就可以用甘油树胶封片拍照了。
经验六
形态学方法
免疫组织化学
实验对象：石蜡切片
步骤：
①石蜡切片脱蜡和水化后. 用PBS冲洗3次. 每次5 Min。
②组织抗原修复. 修复完自然放置至室温。
③每张切片加1滴或50 μl过氧化酶阻断剂 (试剂A). 室温下孵育10 Min.
以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次. 每次5 Min。
④除去PBS液. 每张切片加1滴或50 μl正常非免疫动物血清 (试剂. 室温下孵育10 Min。
⑤每张切片加1滴或50 μl 0. 1%的Triton X-100破膜. 室温下孵育10 Min。
⑥除去血清. 每张切片加1滴或50 μl的一抗体 (稀释浓度为1：100). 4 ℃孵育过夜。PBS冲洗3次. 每次5 Min。
⑦除去PBS液. 每张切片加1滴或50 μl生物素标记的第二抗体 (试剂C). 室温下孵育10 Min。PBS冲洗3次. 每次5 Min。
⑧除去PBS液. 每张切片加1滴或50 μl链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液 (试剂D). 室温下孵育10 Min。PBS冲洗3次. 每次5 Min。
⑨除去PBS液. 用PBST溶液漂洗切片3次. 每次10 Min。
⑩除去PBS液. 每张切片加2滴或100 μl新鲜配制的DAB溶液. 显微镜下观察1～3 Min。
自来水冲洗. 苏木素复染. PBS或自来水冲洗返蓝。
梯度酒精脱水干燥. 二甲苯透明。
中性树胶封固。
数码相机拍照保存。
5）我的窍门或者心得体会：以上我写的是常规的免疫组化的步骤. 但其实我试过在苏木素复燃. 氨水返蓝后不用再繁琐的进行梯度酒精脱水以及二甲苯透明的这些步骤. 直接将玻片放在晾片板上自然晾干即可封片拍照观察. 而且效果也很好. 因为梯度酒精的作用就是脱水. 跟你自然晾干作用一样；中性树胶里面本身就有二甲苯. 因为在某种程度上可以起到透明的作用。这样一来. 整个免疫组化每次就可以节省一个小时的时间了。大家可以试试看。
经验七
形态学方法
载玻片处理（免疫组化用）
实验对象：载玻片
（一）我们大学多个实验室用的载玻片处理方法：
1. 普通的载玻片（例如： 帆船牌）. 将其排列在玻片架上. 置于热水中. 加洗衣粉. 煮沸30分钟
2. 倾去洗衣粉水. 自来水冲洗2遍. 把洗衣粉冲干净
3. 超声清洗（65 w. 10 Min）
4. 酸缸内浸泡过夜
5. 自酸缸内取出. 自来水冲洗
6. 超声清洗（65 w. 10 Min）
7. 双蒸水冲洗. 烘干
8. 75%酒精浸泡过夜
9. 双蒸水冲洗. 烘干
10. 过明胶（3次）
（二）我改良的载玻片处理方法：
1. 购买洁净度高的载玻片（例如：世泰）
2. 置架排列后. 75%酒精中浸泡过夜
3. 取出后. 双蒸水洗涤. 烘干
4. 过明胶（3次）
我的窍门或心得体会：
1. 经改良后的步骤简单快捷. 节省大量时间。旧方法最起码要4天时间. 新方法2天就完成了。当处理少量载玻片可能不觉得有多大差异. 但如果你主要研究形态学的话. 处理几百张载玻片的时候. 就可以体验到这两种方法的差别。
2. 很多人用多聚赖氨酸处理载玻片. 个人觉得还是明胶可靠. 很少掉片. 比较过自己用多聚赖氨酸处理的载玻片或者是直接从公司购买的多聚赖氨酸处理的载玻片. 都有不同程度的掉片现象. 做石蜡切片的可能相对还好一些. 但是冰冻切片. 个人感觉明胶处理的的载玻片明显优于多聚赖氨酸处理的载玻片。并且. 明胶经济实惠. 非常便宜. 而多聚赖氨酸很贵；过明胶可以用个大烧杯批量处理. 过多聚赖氨酸的时候那可是细活。
经验八
（1）实验技术大类：
动物模型建立
（2）具体实验技术名称：
经侧脑室注射给药方法
（3）实验对象：
大鼠
（4）简要步骤
1) 手术器械高温消毒. 立体定位仪经碘酊擦拭后酒精脱碘。
2) 大鼠先经10％水合氯醛按3. 5 Ml?B w的剂量腹腔注射麻醉. 待麻醉后颅顶部备皮。
3) 大鼠头部按颅骨水平位 (即调整门齿杆. 使前囟与人字点相平) 被固定在立体定位仪上. 常规消毒. 剪开颅顶皮肤. 暴露颅骨的前囟. 3%的双氧水擦除骨膜. 拭去血迹。
4) 参考 geor ge Paxinos & C harles watson所著的大鼠脑立体定位图谱 (T he rat brain in stereotaxic coordinates. 3rd edition)所示. 选取前囟后0. 8 M M (AP：0. 8 M M). 左侧旁开1. 5 M M (L: 1. 5 M M) 位点为左侧脑室注射点. 用电钻在颅骨该位点钻孔备用。
5) 将5 μl微量进样器抽吸好各组所需注射试剂 (1. 5 μL) 后. 固定于立体定位仪垂直臂杆上. 以颅骨平面为参考平面. 旋转臂杆使针头经颅骨表面的侧脑室注射点钻孔处进针至颅骨平面下4. 3 M M深度 (AP: -0. 8 M M. L: 1. 5 M M. V: -4. 3 M M) 后固定。
6) 缓慢旋转微量进样器尾端旋钮. 使1. 5μL注射液缓慢注入. 注射时间5 Min. 以尽量减轻人为因素所致损伤. 同时观察大鼠呼吸. 心率等生命体征。注射后留置针头5 Min. 使注射液尽量全部被吸收以避免随针头带出。旋转立体定位仪垂直杆缓慢退针. 退出颅骨平面后. 取下微量进样器。
7) 解除耳杆. 牙套等固定装置. 将大鼠单独置于鼠笼中等待麻醉苏醒。
（5）我的窍门或者心得体会
暴露前囟的时候使用3%双氧水擦除颅骨骨膜. 骨缝处的结缔组织经双氧水的作用后会显示出清晰的"十"字交叉. 交叉点即为前囟. 定位准确；另外. 双氧水擦除骨膜还可以起到止血的作用。
经验九
（一）实验技术大类：
形态学方法
（二）具体实验技术名称：
Neo-Ti M M染色
（三）实验对象：
大鼠脑组织冰冻切片
（四）简要实验步骤
1. 大鼠灌注取脑. 对半切开. 左侧大脑半球用于Neo-Ti M M染色. 右侧大脑半球用于免疫组化染色。
2. 取左侧脑半球. 先置于1%硫化钠 (Na2S) 溶液浸泡30 Min. 转置于3%戊二醛/4%多聚甲醛/0. 1 Mol/L PB溶液中固定48 h。
3. 转置20％. 30％蔗糖/0. 1 Mol/L PB溶液梯度脱水. 直至标本在标本瓶中沉底后取出. 滤纸吸干表面水分。
4. 标本经OCT包埋剂包埋. 连续冠状位切片. 层厚45 μ M。每隔4张取1张. 留取3个切片平面. 用于Neo-Ti M M染色。
5. 37 ℃烤箱风干1 h. 置于阴凉处自然风干过夜. 4 ℃冰箱内储存备用。
6. Neo-Ti M M 染色方法：
(1) 制备显色剂：
① 50%阿拉伯胶60 Ml
② 柠檬酸缓冲液10 Ml (含2. 55 g柠檬酸和2. 35 g柠檬酸钠的)
③ 5. 67%对苯二酚溶液30 Ml (含对苯二酚1. 7 g)
④ 17%硝酸银0. 5 Ml (含硝酸银0. 085 g)
染色前于暗室内将①. ②. ③三液充分混匀. 再加入④充分混匀. 即配即用。
(2) 恒温避光染色：置于恒温37 ℃摇床中避光染色120 Min。
(3) 充分水洗：流水冲洗至少30 Min。
(4) 梯度脱水：70%. 80%. 95%酒精各脱水3 Min. 100%酒精 ( I ). (II) 各脱水5 Min。
(5) 透明：二甲苯 ( I ). 二甲苯 (II) 各透明5 Min。
封片： 中性树胶封片保存。
我的窍门或者心得体会:
Neo-Ti M M染色传统方法要硫化钠 (Na2S)经心脏灌注. 但是如果要你要利用脑组织标本检测多个指标. 不能灌注硫化钠的话. 可以生理盐水灌注后取脑. 对半切开. 左右脑作不同的处理。取出的脑标本再浸泡硫化钠. 同样可以做出满意的Neo-Ti M M染色效果。另一半脑组织可以做其他处理。
经验十
（一）实验技术大类：
细胞培养. 免疫组化
（二）具体实验技术名称：
细胞爬片. 固定. 免疫组化
（三）实验对象：
细胞
（四）简要步骤
细胞爬片一般的过程是：在孔板中放一块大小合适切无菌的玻片. 然后把消化均匀的悬浊液吸入孔板中覆盖玻片. 然后放入培养箱培养. 第二天观察细胞状况. 如果爬片良好. 单层状. 那么就可以吸取培养液. PBS冲洗后. 用多聚甲醛固定. 然后将固定的玻片拿出. 进行后续的细胞免疫组化。
（五）我的窍门或者心得体会
我改良的方法：直接用那种独立的一次性的塑料培养皿. 大小大概相当于一个24孔板的孔. 然后按照上面的方法. 把消化均匀的悬浊液吸入培养皿中. 不过培养皿中不用再放玻片了. 然后放入培养箱培养. 第二天观察细胞状况. 如果爬片良好.
单层状. 那么就可以吸取培养液. PBS冲洗后. 用多聚甲醛固定. 然后固定好之后. 用一个圆锥似的尖的利器在培养皿的底壁上画一个大小适当的圆. 要用力一点. 使得这个圆的边缘形成一个小沟. 这样一来. 在后续的细胞免疫组化过程中. 你要的各种液体. 包括抗体之类的. 都可以以这个圆为目标. 因为有小沟的存在. 所加的液体不会到处流. 节省了抗体和试剂. 等做完免疫组化时. 也同样是不用进行酒精和二甲苯透明. 直接晾干. 然后放在显微镜下直接观察和拍照。
另外如果经费允许的话. 可以直接买那种用来做共聚焦的一次性独立的塑料培养皿. 这种培养皿的底壁上已经设计了现成的一个圆形的小沟. 不用你再自己画一个小沟了. 而且特别干净。只是价格比较贵。
经验十一
（一）实验技术大类：
分子生物学
（二）具体实验技术名称：
微小组织的RNA提取技巧
（三）实验对象：
视网膜等微小组织
（四）简要步骤
对于大块的组织提RNA常规的就是用玻璃的匀浆器冰上操作. 但对于微量的组织. 比如说刚出生的小鼠的视网膜如何提取RNA呢？其中最关键的步骤是怎么找一种合适的仪器. 用什么合适的方法才能够提取出RNA呢？毕竟视网膜非常小. 只有大概一滴胶水那么大小. 即使用最普通的玻璃匀浆器. 也显得非常大. 视网膜都会粘在容器壁上. 最后视网膜都没了。
（五）我的窍门或者心得体会
首先我用的容器是1. 5毫升的无菌EP管. 一个可以放下1. 5毫升的无菌EP管的冰盒. 还有最重要的一个器具-- handy Pestle微量匀浆器. 日本TOYOBO公司. 货号是： h MX-301. 这种器具最大的特点就是. 它的头端是一个分叉的结构. 有四个叉. 这样一来. 当你用它来挤压放在EP管中的视网膜组织时. 由于EP管的底部是圆锥形的. 那么由于挤压的原因. 器具头端的四个分叉就会被撑起来.
正好牢牢地把组织卡在EP管的底部. 这样一来. 你就可以用力进行匀浆了. 不过要把EP管插在冰盒的空里面匀浆. 在加入TRIZOL . 由于EP管只有1. 5毫升的体积. 第一次先加大概1. 5毫升的TRIZOL. 然后用力匀浆. 匀浆的差不多了. 再加入0. 5毫升的TRIZOL. 直至匀浆到无明显可见的大颗粒物位置。不要一下子加1毫升TRIZOL. 那样等你用力匀浆时很容易溢出来. 而且液体太多. 组织不容易固定. 会在TRIZOL中飘来飘去。
经验十二
1）实验技术大类：
动物建模
（2）具体实验技术名称：
早产儿视网膜病变动物模型建立中如何防止母鼠对调后食小鼠的问题
（3）实验对象：
C57BL/6J哺乳母鼠与小鼠
4）模型制作：我在上面已经写过了ROP模型如何建立了。在这个模型中. 由于小鼠要在密闭的高氧箱里待5天才能出来. 而小鼠又为断乳. 因此母乳也必须和小鼠一块被放进高氧箱里. 但问题是. 小鼠可以耐受5天的高氧. 而母鼠则不能. 一般3天之后就会因为肺水肿死亡. 因此就必须每两天把空气组和高氧组的母鼠进行调换. 来哺乳对方的鼠仔。这样就可以避免母鼠连续在高氧箱中待5天而死亡. 但问题又来了. 当你对调过母鼠后. 由于老鼠是靠气味来判断自己的鼠仔的. 母鼠会把对方的鼠仔咬死. 如何防止对调后母鼠食小鼠呢？
（五）我的窍门或者心得体会
首先把各笼中的母鼠拿出来. 立即做好标记. 以免待会搞错了. 高氧组母鼠还是空气组母鼠。然后把高氧组的鼠仔和空气组的鼠仔进行对调. 对调后用对方笼子中的垫料. 最后是混有粪便的垫料去擦小鼠的身体. 尽可能的让小鼠身上染上对方笼子中的气味. 也就是对方母鼠的气味.
过二十分钟左右再按照对应关系把母鼠放入相应的笼中. 然后在旁边观察一会. 看看母鼠是否咬对调后的对方的鼠仔. 我观察的结果是. 没有发现咬的. 只要气味足够大. 母鼠就分辨不出来. 就会当做自己的鼠仔进行哺乳。
另外可以在笼子中加一些瓜子. 花生之类的零食. 有催奶的作用. 而且母鼠营养好了. 也就不会乱咬小鼠了。
经验十三
1）实验技术大类：
1）实验技术大类：
动物实验
（2）具体实验技术名称：
心肌灌注
（3）实验对象：
新生C57BL/6J小鼠
（四）简要步骤
①选取出生几天的C57BL/6J小鼠。
②麻醉 小鼠称重. 2% 戊巴比妥钠2. 5 Ml腹腔注射麻醉。
③灌注 打开幼鼠胸腔. 暴露心脏. 用头皮针刺入左心室同时用显微剪刀剪开右心房. 先用生理盐水灌注约2～3 Min. 直至肝脏变白. 流出的液体澄清时. 再灌注4%多聚甲醛约5 Min。
（五）我的窍门或者心得体会
由于刚出生的C57BL/6J小鼠非常小. 心脏更小. 因此灌注时还是需要一点技巧的。打开胸腔后. 仔细观察. 是可以从解剖上分辨出左心室和右心房的. 右心房在心耳附近. 心耳比较好辨认. 用那种新生儿科最小型号的头皮针. 左手用有齿弯镊固定心脏. 右手持头皮针针头. 瞄准心脏搏动最明显处进针. 注意不要进的太深. 以免刺破心脏. 同时辨认出右心房. 把右心房剪开. 然后就可以缓缓进行灌注了. 第一次最好先灌注生理盐水. 把心脏以及血管中的血液和细胞冲出来. 约2～3 Min. 直至肝脏变白. 流出的液体澄清时. 表明已经冲洗干净了. 用同样的方法灌注4%多聚甲醛。然后摘除小鼠眼球. 固定在4%多聚甲醛中。第一的4%多聚甲醛固定叫做前固定. 第二次的是后固定。
经验十四
（1）实验技术大类：
医用材料修饰
（2）具体实验技术名称：
医用材料表面层层静电组装技术
（3）实验对象：
各种医用材料均可尝试
（四）简要步骤
1 将材料交替带有正电荷的聚电解质溶液. 静止一段时间. 取出冲洗干净. 去掉吸附不牢的聚电解质。
2 再将材料交替浸入带有负电荷的聚电解质溶液。静止一段时间. 取出冲洗干净. 去掉吸附不牢的聚电解质。循环以上的过程即可得到有序的纳米多层膜体系。
说明：多层薄膜材料的性质取决于每一单层分子的特性及各层薄膜的组装顺序。膜的形成动力是相反电荷组分之问的静电吸引力. 而同种电荷的排斥力又使每一层的吸附量在一定的时间内达到饱和. 正是这两种力确保膜稳定地成线性增长。利用这种技术. 可以将生物活性物质包埋到超薄膜中. 然后在合适的时机释放. 发挥其生物学作用。
（五）我的窍门或者心得体会
组装完成后. 如何对组装的材料进行有效的评价:可以在材料表面接种想要的细胞（例如骨髓基质干细胞）. 通过判断细胞的活性 增殖效率 细胞内生物活性物质的表达情况来进行评价。
经验十五
1）实验技术大类：
SD大鼠模型
（2）具体实验技术名称：
经腹腔注射给药/心肌灌注
（3）实验对象：
SD大鼠
（4）简要步骤
1选取出生几天的SD鼠。
2麻醉 小鼠称重. 2% 戊巴比妥钠2. 5 Ml腹腔注射麻醉。
3灌注 打开幼鼠胸腔. 暴露心脏. 用头皮针刺入左心室同时用显微剪刀剪开右心房. 先用生理盐水灌注约2～3 Min. 直至肝脏变白. 流出的液体澄清时. 再灌注4%多聚甲醛约5 Min。
4手术器械高温消毒. 立体定位仪经碘酊擦拭后酒精脱碘。
5 大鼠先经10％水合氯醛按3. 5 Ml?B w的剂量腹腔注射麻醉. 待麻醉后颅顶部备皮。
6 大鼠头部按颅骨水平位 (即调整门齿杆. 使前囟与人字点相平) 被固定在立体定位仪上. 常规消毒. 剪开颅顶皮肤. 暴露颅骨的前囟. 3%的双氧水擦除骨膜. 拭去血迹。
7 观察大鼠呼吸. 心率等生命体征。注射后留置针头5 Min. 使注射液尽量全部被吸收以避免随针头带出。旋转立体定位仪垂直杆缓慢退针. 退出颅骨平面后. 取下微量进样器。
7) 解除耳杆. 牙套等固定装置. 将大鼠单独置于鼠笼中等待麻醉苏醒。
我的窍门或者心得体会
小鼠非常小. 心脏更小. 因此灌注时还是需要一点技巧的。打开胸腔后. 仔细观察. 是可以从解剖上分辨出左心室和右心房的. 右心房在心耳附近. 心耳比较好辨认. 用那种新生儿科最小型号的头皮针. 左手用有齿弯镊固定心脏. 右手持头皮针针头. 瞄准心脏搏动最明显处进针. 注意不要进的太深. 以免刺破心脏. 同时辨认出右心房. 把右心房剪开. 然后就可以缓缓进行灌注了. 第一次最好先灌注生理盐水. 把心脏以及血管中的血液和细胞冲出来. 约2～3 Min. 直至肝脏变白. 流出的液体澄清时. 表明已经冲洗干净了. 用同样的方法灌注4%多聚甲醛。
暴露前囟的时候使用3%双氧水擦除颅骨骨膜. 骨缝处的结缔组织经双氧水的作用后会显示出清晰的"十"字交叉. 交叉点即为前囟. 定位准确；另外. 双氧水擦除骨膜还可以起到止血的作用。
经验十六
1. 实验技术
电生理
2. 具体实验技术
离体脑薄片活性的保持
3. 实验材料
大鼠脑. 尤其成年大鼠. 因幼年大鼠脑薄片活性容易保持
4. 具体步骤（窍门）
1）切片及孵育中使用加入谷氨酸拮抗剂及高镁低钙的特殊ACSF(in M M): NaCl (130). Na hCO3 (30). KCl (3. 50). K h2PO4 (1. 10). M gCl2 (6. 0). CaCl2 (1. 0). glucose (10). supple Mented wit h kynurenic acid (2. 0).
2）切片后脑片放在32-35度水浴中的c ha Mber中孵育1小时. 然后转到室温. 换正常ACSF
5. 体会
谷氨酸拮抗剂. 高镁低钙能够有效地减少兴奋毒性. 保持脑活性
经验十七
（1）实验技术大类：
形态学
（2）具体实验技术名称：
在做石蜡切片之前. 如何更好的标记刚出生的小鼠眼球. 以利于石蜡固定. 确定切片方向。
（3）实验对象：
新生C57BL/6J小鼠
（4）简要步骤
在做免疫组化或者 hE染色等形态学之前. 很重要的一个步骤就是对标本进行固定. 石蜡包埋. 然后做出合格的切片. 这是后续实验的基础与前提. 直接关系到你的后续实验的质量. 甚至起决定性作用. 要是你等动物都处死完了. 切片也做出来了. 做形态学染色后才发现由于标本的固定方向不对而导致切片时没有切到你想要观察的组织部位. 那就为时已晚了. 既浪费金钱. 又浪费时间。因此标本的固定标记与方向问题还是很重要的。我以新生C57BL/6J小鼠眼球为例说一下当时我是如何进行固定标记和解决固定方向问题的. 希望对大家有些许帮助。
（5）我的窍门或者心得体会：
对于大的组织. 或者组织分布均匀. 各个部位差异不大时. 固定和标记方向没什么大的影响. 比如成年大鼠肺组织的固定. 基本上怎么切对于后续做形态学染色影响不大。但对于像小鼠眼球. 尤其是刚出生的小鼠眼球. 眼球结构还不是太清晰. 良好的固定和标记就显得很重要了. 比如你要进行新生小鼠眼球的视网膜染色. 那就要保证固定后切片时能切到视网膜的部位. 如果最终切到的都是矢状面的角膜组织. 那就惨了. 或者是水平面切的话. 也不好. 切到的视网膜结果较少. 不利于后续的染色及观察. 因此最好进行合适固定后切到整个眼球的冠状面。
我在取完小鼠研究后. 曾做过一下的尝试：1. 最初想着用胎盘蓝在眼球上点一下做标记. 然后包埋和切片时就可以知道这个做标记的是小鼠眼球的哪个部位了. 但后来发现这种方法对于那些无色的鼠. 比如SD鼠可行. 但对于有色鼠则不行. 因为有色鼠的眼球有颜色. 比如C57BL/6J小鼠眼球就是黑色的. 胎盘蓝染上去根本看不出来；用酚红也染过. 还是会被小鼠的黑色给遮蔽；2. 我又想着用一个大头针穿在眼球上来标记. 但是也不行. 一是因为大头针肉眼看着还算小. 但在显微镜下一看. 超大的. 根本没办法穿进小鼠眼球；另外如果真的穿进去还有问题. 那就是破口太大了. 眼球组织里的玻璃体等液体就流出来了. 整个眼球就会塌陷. 后续的包埋和切片就没法做了。
我的做法是. 在取小鼠眼球时要尽量剔除眼球周边的结缔组织. 以免影响到组织结构的辨认；但是却要尽量保存视网膜神经. 尽可能的留长一点. 这样你在进行石蜡固定时就可以根据这条长长的视网膜神经来定位了. 从而后续的切片你也知道应该如何切才能尽可能多. 尽可能好的切到你要观察的视网膜组织了。
经验十八
（1）实验技术大类：
形态学
（2）具体实验技术名称：
冰冻切片
（3）实验对象：
脑组织
（4）简要实验步骤
1. 经心脏生理盐水灌注取脑. 对半切开. 4%多聚甲醛浸泡固定（4 ℃）
2. 20％. 30％蔗糖/0. 1 M PB溶液梯度脱水. 直至标本在标本瓶中沉底。
3. 标本在30％蔗糖/0. 1 Mol/L PB溶液脱水至沉底后取出. 滤纸吸干表面水分。
4. 标本经OCT包埋剂包埋. 连续冠状位切片
（5）我的经验或者心得体会：
1. 脑组织相对于其它器官含水量尤其丰富. 冰冻切片时冷冻的速度要快. 冻结的速度越慢. 冰晶形成越多。
2. 切片时的温度很重要. 对于一般的组织切片. 切头最适宜的温度在-22 ℃左右. 但脑组织不宜太低. 温度设置为：切头温度-19 ℃. 机身温度为-21 ℃。
3. 包埋的时候要在冰冻切片机内操作。先预冷切片的底座. 然后再将标本放在底座上预冷. 由于标本表面含有水分. 自然就会与底座粘紧。预冷至标本表面长白霜. 所需时间长短不一. 1c M3大小的标本. 约需5 Min。
4. 包埋时. 由下到上. 尽量均匀涂抹. 不要留空隙. 特别是底部. 螺旋状向上盘旋。标本周围包埋剂的厚度在1-2 M M之间. 底部3-4 M M为宜。
5. OCT包埋剂不能包的太多或太少。太多. 切出来的脑组织切片容易卷曲；太少. 容易卷曲之外. 标本底部的包埋剂过少. 会导致固定不稳. 标本容易与底座分离。
经验十九
（1）实验技术大类：
形态学
（2）具体实验技术名称：
冰冻切片裱片方法
（3）实验对象：
组织切片
（4）简要实验步骤
将组织切片标本贴附于载玻片上
我的经验或者心得体会：
裱片常用有两种方法：
1. 漂浮法。切出来的脑标本先转移到0. 01 Mol/L的PBS中. 然后在裱到载玻片上. 此法需要的时间精力太多. 标本容易在裱的过程中损坏。如果切片平面太多 . 则无法一一辨认清楚. 更难以按切片的顺序连续裱片。
2. 直接裱片法。一般的同学切下组织后. 直接就拿载玻片往标本上面粘. 结果很多都是皱巴巴的. 不平整. 根本无法进行后面的实验。我的经验是先在载玻片上要裱片的部位预先涂上0. 01 Mol/L的PBS. 掀起冰冻切片机中压片的挡板. 迅速将沾有PBS的区域直接去贴切下的标本。可以观察到. 切片像是受到一股吸引力一样. 自动贴在载玻片上并且自然展开. 遇到有小皱折的地方. 可以用小毛笔. 蘸少许PBS溶液. 涂抹在标本上. 由于上下均有一层PBS液. 可以自由的移动到你想要调整的切片部位和形态。调整好后. 扫掉多余的PBS液. 晾干切片备用。
经验二十
（1）实验技术大类：
形态学
（2）具体实验技术名称：
组织切片封片
（3） 实验对象：
组织切片
（4）简要实验步骤
免疫组织化学或者免疫荧光染色后的切片最后的封片
我的经验或者心得体会：
无论是经脱水透明还是直接干燥的切片. 最后都需要用中性树胶或者甘油封片。在封片时. 为了避免组织被颗粒污染. 尽量用新的或干净的棉签棒/玻璃棒. 这样可以避免将桌上的粉尘带入到中性树胶或者甘油中. 并最后带入切片中。另外在封片前尽量不要摇晃封片剂产生小的气泡。封片时可以将封片剂沿着盖玻片的边缘递成一条线. 然后将切片先垂直靠近载波片滴有封片剂的一边. 慢慢倾斜45度左右. 可发现载波片与盖波片慢慢的合在一起. 最后轻轻的复位至垂直即可。
经验二十一
（1）实验技术大类：
形态学
（2）具体实验技术名称：
视网膜取材
（3） 实验对象：
SD大鼠
（4）简要步骤：
沿角巩膜缘剪开眼球. 剥出晶状体. 去除玻璃体
（5）我的窍门或者心得体会：
视网膜剥离不利于视网膜冰冻切片的获取. 即容易因为视网膜剥离造成贴片时视网膜的折叠。这需要在取材时注意。一是在剪开眼球时避免球内压力很大. 这样容易造成视网膜剥离。可以找一根银针穿破角膜. 注意穿破过程中不要使劲挤压眼球。另外就是剪角膜的位置十分重要. 先用眼科弯剪从银针尖剪一个口子. 并以此口子为出发点剪开角膜至角膜巩膜缘. 弯剪弧度与角膜缘弧度一致。注意一定要靠近角膜而不是巩膜来剪. 否则容易造成视网膜剥离。在用弯头尖镊沿着角膜巩膜缘和晶状体之间的空间划一圈以去除晶状体韧带. 并用弯头将晶状体拨出。取少量棉花缠在弯头尖镊尖头上. 轻轻的将玻璃体去除. 但要尽可能小心不要碰到视网膜。
经验二十二
（1）实验技术大类：
动物建模
（2）具体实验技术名称：
视神经切断模型
（3） 实验对象：
SD大鼠
（4）模型制作：
麻醉好动物后. 经右眶上缘切开皮肤. 显微镜下暴露右侧眼球. 在球后1 M M处纵行切开视神经鞘. 横断视神经. 注意避免损伤周围血管
（5）我的窍门或者心得体会：
本模型最大的并发症就是术后白内障及球后出血. 如果处理不当. 样本量很难凑足。我感觉手轻及熟练是关键。在分离眶结缔组织时. 尽量不用眼科剪（毕竟剪刀锐利. 容易伤及血管）. 可以用细的眼科止血钳分离. 尽量不要将泪腺分离出来. 这样不利于后续的视神经的切取。当分离进入到眼眶时. 注意在将眼球向下牵拉以暴露视神经的过程中. 手的力度一定要控制. 牵拉的时间要尽可能的缩短（如果手够熟练的话也可以减少这部分时间）. 当观察到视神经. 可以用眼科止血钳轻轻的将视神经控制在两个钳尖之间. 不要使劲. 避免伤害视神经。此时注意一定不要再一味的将眼球向下使劲的牵拉了. 手应该放松. 只要保证视神经在两个眼科止血钳的钳尖之间就可以了。这样当你换手拿手术刀后就只需要短时间的向下牵拉眼球即可定位好视神经了。视神经切断的时候注意观察有无出血. 放置少量的青霉素粉可以减少术后眼球感染引起的白内障。术后需要将眼球轻轻回按入眼眶. 滴加眼药水。并注意在动物麻醉后需要滴加眼药水以避免角膜干燥。术后3天之内需要每天滴加眼药水一次. 并观察动物的伤口有无化脓。
经验二十三
（1）实验技术大类：
形态学
（2）具体实验技术名称：
冰冻切片保存
（3）实验对象：
脑组织
（4）简要 实验步骤
1. 0. 01 MPBS及4%多聚甲醛经心灌注取脑. 4%多聚甲醛4 ℃后固定过夜
2. 30％蔗糖脱水两次. 直至标本在标本瓶中沉底。
3. OCT包埋切片
（5）我的经验或者心得体会：
1. 第一次脱水时可以用30%的蔗糖. 当组织沉底后. 换第二次30%的蔗糖时. 不要丢弃第一次的蔗糖. 由于已经有组织内的水进入到蔗糖中去了. 所以实际上蔗糖的浓度一定低于30%. 可以将这部分糖收集起来作为下次沉糖的第一次脱水用糖. 这样可以减少糖的耗费. 对组织没哟任何影响。
2. 为了减少冰晶的存在. 在冰冻组织时. 可以将经OCT包埋剂包埋好的标本放在一个小的塑料平皿中. 倒入事先放置在-80度保存的2 甲基丁烷（不要蔓进组织就行）. 让组织速冻. 可以减少冰晶. 同时也可以保持直接接触底座的组织底部平整. 并减少修组织时的切片浪费。
3. 为了避免伤害切片机用的刀片. 从-80度冰箱取出的组织需要先放置在冰冻切片机中复温半小时. 以避免组织及包埋剂太硬而伤害刀片。
经验二十四
（1）实验技术大类：
形态学
（2）具体实验技术名称：
冰冻超薄切片裱片方法
（3） 实验对象：
组织切片
（4）简要实验步骤
将超薄的组织冰冻切片标本贴附于载玻片上
我的经验或者心得体会：
对于没有confocal的实验室. 要想做出很漂亮的荧光双标图片. 可以考虑将切片切得非常薄. 最薄可以达到6-8微米. 当然这也对贴片技术提出了挑战。
首先组织必须固定好. 固定好的组织切成薄片不会散开. 而固定不好的组织薄片很快就散开。
建议对这种薄片. 采取漂浮法来贴片. 直接裱片容易不平整。切出的标本放入0. 01 Mol/L的PBS中（注意不要有triton x-100）。陈放的器皿直径也最好要大一些。切片进入到PBS时要尽量的轻. 尽量让组织薄片漂浮在水面. 切不可将组织薄片插入到水面以下. 甚至还搅几下. 也就是说尽量得让组织薄片显示为展开的状态而不是折叠得很厉害的状态。贴片时. 小心的用一个头上是弯勾样的玻璃棒挑出组织. 手要轻. 再小心的让组织漂在不含triton x-100 的0. 01 Mol/L PBS中. 尽可能的保持当时在陈放器皿中的状态. 如果组织直接是展开的状态是最好贴的。如果组织有部分皱褶在上. 可以先将没有皱褶的部分贴在玻片上. 调整玻片的方向. 利用玻片在提起来时产生的水流来帮助折叠的切片顺着水流方向铺平. 当然如果折叠的部分是向下的. 则可以在贴片的过程中轻轻的拨动玻片产生小幅度的水流. 结合细尖的毛笔来帮助向下折叠的组织与原来接触组织脱离并随着水流铺平。
经验二十五
（1）实验技术大类：
形态学
（2）具体实验技术名称：
组织包埋
（3） 实验对象：
组织
（4）简要实验步骤
组织OCT胶包埋
我的经验或者心得体会：
对于包埋组织还有一个省钱妙招。为了减少OCT胶的用量. 可以考虑在包埋前至少半小时将OCT胶和30%蔗糖按1：1混匀. 室温（也可以放置到37度温箱中）静置. 以减少和去除混匀过程中产生的气泡。但注意组织包埋后要放置于冰冻切片机的速冻台上速冻. 否则蔗糖里的水又会有部分回到组织中。几个月下来得出的这么个简单的结论。
经验二十六
（1）实验技术大类：
形态学
（2）具体实验技术名称：
组织切片法 防脱片
（3） 实验对象：
组织切片
（4）简要实验步骤
组织切片后入1%过氧化氢室温下20分钟. 充分洗涤后加入5%动物血清. 加入一抗4度过夜. 第二天充分洗涤后入二抗. 室温下2小时. 充分洗涤后加入ABC试剂. 室温下2小时。洗涤后DAB避光显色
我的经验或者心得体会：
组织切片的一个最让人头痛的问题就是脱片。解决这个问题需要注意几个方面。一是制明胶片时. 可以考虑适当提高明胶浓度；另外即便是冰冻切片在做免疫组织化学染色时都可以先入低于50度的烤箱烤10-20分钟. 这可以非常有效的防止脱片. 同时对一般的组织抗原没有太大的影响；还有一个非常重要的步骤就是加过氧化氢去除内源性过氧化物酶时需要加一定比例的甲醇. 可以消除因为气泡喧开组织从而造成脱片的危险. 同时甲醇的加入也可以稳定抗原抗体的结合。
经验二十七
（1）实验技术大类：
形态学
（2）具体实验技术名称：
免疫组织化学双标
（3） 实验对象：
所有组织
（4）简要实验步骤
组织切片后入1%过氧化氢室温下20分钟. 充分洗涤后加入5%动物血清. 加入一抗4度过夜. 第二天充分洗涤后入二抗. 室温下2小时. 充分洗涤后加入ABC试剂. 室温下2小时。洗涤后DAB避光显色
我的经验或者心得体会：
有时候免疫荧光染色会有自发荧光. 不好保存等缺点. 当需要对两个抗原进行检测二者关系时. 免疫组织化学染色同样也可以达到类似于免疫荧光双标的效果。第一天加一抗时先加一种抗体. 第二天DAB显色洗涤充分后. 加入所需要的第二种抗体的血清. 1小时后加入第二种抗体4度过夜. 第三天经二抗和ABC孵育充分后. 选择不同于第一天的DAB显色方法即可. 如加强法DAB（即0. 05%DAB. 0. 025%氯化钴（CoCl）. 0. 025%氯化镍（NiCl））. 这样两种不同产物均可通过不同的颜色显现出来。
经验二十八
（1）实验技术大类：
形态学试剂
（2）具体实验技术名称：
原液一抗的保存与稀释以及最佳一抗浓度的摸索
（3） 实验对象：
免疫组化一抗
（4）简要步骤：
免疫组化中的一抗是非常重要的试剂. 一般国外大公司的原液一抗最小包装是0. 1毫升. 少则2000大洋. 多则四五千. 因此一抗的保存和稀释就显得尤为重要。下面我说一下我对这个问题的理解和做法。
（5）我的经验或者心得体会：
一般的原液抗体中加有甘油等试剂. 可以在-80度或-20度条件下长期保存. 但稀释过的抗体则不能长期保存. 有资料显示. 稀释后的抗体在4度条件下保存一周. 效价下降30%左右. 保存一个月. 效价下降70%左右。因此抗体的保存和稀释很重要. 最好能达到摸索出最佳的稀释浓度后按照此方法对原液进行集中稀释. 然后批量进行免疫组化的染色。我对于抗体的稀释采取的是"二次稀释法". 具体的做法是这样的：比如你买的是0. 1毫升的原液. 我先用移液枪抽出10微升转移到一个EP管中. 剩余原液仍旧低温保存。一般免疫组化的抗体说明书一抗的推荐浓度在1:50-1:200. 我就会先把抽出来的5微升一抗进行稀释50倍. 这样就得到了1:50的稀释抗体500微升. 然后进行二次稀释. 再从这500微升抗体中抽取适量（比如10微升）的抗体继续稀释2倍. 即稀释为1:100. 好了. 下面就用这些1:100浓度的抗体进行染色. 如果与同时做的阳性对照与阴性对照. 做出来了. 那就继续再稀释为1:150进行染色. 如果同样做出来了. 那就再稀释为最大的稀释浓度1:200来做；如果1:100做出来了. 但是稀释为1:150时却做不出来了. 或者染色效果不好了. 那就说明1:100是最佳的抗体稀释浓度。以后就把原液抗体稀释为1:100进行批量染色。如果稀释为最大的1:200也同样能做出来. 那么就用1:200进行稀释批量染色。最终的目的就是：把原液抗体稀释为能够做出来最佳免疫组化染色效果的最大稀释浓度. 即：染色效果最好而且最节省抗体。
经验二十九
形态学方法
免疫组织化学过程中的注意事项
实验对象：石蜡切片
步骤：同前。
①石蜡切片脱蜡和水化后. 用PBS冲洗3次. 每次5 Min。
②组织抗原修复. 修复完自然放置至室温。
③每张切片加1滴或50 μl过氧化酶阻断剂 (试剂A). 室温下孵育10 Min.
以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次. 每次5 Min。
④除去PBS液. 每张切片加1滴或50 μl正常非免疫动物血清 (试剂B）. 室温下孵育10 Min。
⑤除去血清. 每张切片加1滴或50 μl 0. 1%的Triton X-100破膜. 室温下孵育10 Min。PBS冲洗3次. 每次5 Min。
⑥每张切片加1滴或50 μl的一抗体 (稀释浓度为1：100). 4 ℃孵育过夜。PBS冲洗3次. 每次5 Min。
⑦除去PBS液. 每张切片加1滴或50 μl生物素标记的第二抗体 (试剂C). 室温下孵育10 Min。PBS冲洗3次. 每次5 Min。
⑧除去PBS液. 每张切片加1滴或50 μl链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液 (试剂D). 室温下孵育10 Min。PBS冲洗3次. 每次5 Min。
⑨除去PBS液. 用PBST溶液漂洗切片3次. 每次10 Min。
⑩除去PBS液. 每张切片加2滴或100 μl新鲜配制的DAB溶液. 显微镜下观察1～3 Min。
11自来水冲洗. 苏木素复染. PBS或自来水冲洗返蓝。
12中性树胶封固。
13数码相机拍照保存。
5）过程中需要注意的事项或技巧：
1. 在进行第一步的脱蜡至水. 其实最好先进行空白片的烘烤. 把空白片放在58度左右的烤箱中进行烘烤. 大概4~6小时. 这样有两个目的：第一. 可使玻片上的组织与玻片贴的更紧；第二. 可以尽可能的除去玻片上的石蜡. 这样就可减少后续染色过程中的非特异背景染色。
2. 过程中的"用PBS冲洗3次. 每次5 Min"我见过有同学是用那种塑料的免疫组化盒子. 然后把玻片放进架子上. 用手拿着架子在免疫组化盒中进行不停得上下提拉. 以达到充分漂洗的目的. 这样效果会很不错. 但太累人了. 每一次都要不停得提拉15分钟。我的做法是. 把放有玻片的架子放进免疫组化盒中后. 再把免疫组化盒放在做 wESTERN BLOT 的摇床上. 调整适当的速度. 这样放在架子上的玻片就会随着摇床的摇摆而来回摇摆. 达到漂洗的目的。
3. 每次滴加试剂时尽可能的超出标本的边缘稍许. 以防止边缘没有液体覆盖增加非特异染色；另外除去液体. 继续滴加下一种液体时动作一定要快. 不然也是会干片. 增加非特异染色。
4. 抗原修复首选高压修复. 效果最好。其次是微波修复。EDTA修复液效果最好. 柠檬酸效果其次。
5. 第四步中你可以看到. 没有"PBS冲洗3次. 每次5 Min。"这样的说明. 对了. 这一步是达到用非免疫动物血清封闭非特异抗原的目的. 如果你冲洗了. 则整个实验就白做了. 这一步切忌。
6. 如果抗原时表达在包膜的. 则破膜与否不是太重要；但如果抗原是表达在胞浆的. 则最好破膜。
7. 一抗孵育最好选择4度过夜. 抗原抗体反应比较温和；
8. DAB染色时间把握. 可以采取镜控。滴完DAB后迅速在显微镜下观察. 最佳的时间点是. 你要观察部位的胞浆出现了橙黄色. 而其他背景还没有开始变黄。
9. 还是不用梯度酒精和二甲苯作用. 直接晾干. 封片. 观察拍照。
经验三十
（一）实验技术大类：
细胞培养
（二）具体实验技术名称：
干贴壁法C57/6J小鼠视网膜组织成纤维细胞原代培养
（三）实验对象：
C57/6J小鼠
（四）简要步骤
小鼠麻醉或颈椎脱臼处死后. 将小鼠的尾巴提起. 整个身体浸入装有75%酒精的烧杯中3sec左右（默数5下）. 取出放置到灭菌的培养皿中. 移入工作台内。用有齿弯镊迅速摘除小鼠眼球. 转移至超净台中的解剖显微镜载物台上的冰盒上. 冰盒上覆盖经过无菌处理（120度烘烤4-6小时）的平展的锡纸。用眼科显微器械（显微镊. 显微剪刀. 显微剔刀等）在显微镜下仔细剥离视网膜（具体步骤可见上面帖子中的《视网膜铺片ADP酶染色》）剥离出视网膜组织后. 迅速用显微剔刀转移至提前准备好堵塞细胞培养瓶或培养皿中. 接种于底壁上. 每瓶20－25块左右. 每小块间距0. 5c M左右。组织块放置好后. 轻轻将培养瓶翻转. 让瓶底朝上. 向瓶内加入2 Ml左右的培养液. 盖好瓶盖. 将培养瓶倾斜放置在温箱中. 干贴壁2－4小时后. 将培养瓶慢慢翻转平放. 继续静置培养。注意上述操作过程中动作要轻柔. 让液体慢慢覆盖组织小块. 严禁动作过快致使液体产生的冲力使粘贴的组织块飘起而造成原代培养的失败。37 ℃. 5％ CO2培养箱培养. 24 h补加培养液后继续培养. 48 h换液. 更换2－3 Ml即可。N d（不同细胞时间不同）后细胞接近融合时. 弃去培养液. D- hanks液轻洗3次. 加入0. 125％胰酶消化1 Min. 用含15％ FBS的 h-D ME M培养液终止消化. 吸管轻轻吹打细胞. 收集细胞悬液. 1 000 r／ Min离心3 Min. 弃上清. 用15％ FBS的 h-D ME M培养液。按1：2接种传代。
（五）我的窍门或者心得体会
上面我写的是我当时尝试培养视网膜成纤维细胞的过程. 后来证实视网膜中应该是没有成纤维细胞的. 不过这个过程可以适合培养视网膜中的其他细胞. 比如内皮细胞等；或者其他组织的细胞。注意事项：
1. 最好是在冰上操作. 动作要快. 可以减少细胞死亡与组织边缘变干；
2. 仔细剥离视网膜. 尽可能的除净其他组织. 比如巩膜. 脉络膜等；
3. 视网膜取出来后. 可以先在事先准备好的无菌的PBS或者D- hanks液中漂洗. 以除净视网膜上沾染的其他组织；漂洗完后再在事先准备好的完全培养基中沾一下. 目的有两个：其一可以使视网膜组织中浸有完全培养基. 在后续的干贴壁中不至于缺乏营养而完全坏死；其二. 完全培养基中有血清. 浸有血清的视网膜可以更好的贴紧细胞培养瓶瓶壁。
4. 将培养瓶翻转. 使沾有视网膜组织的底壁朝上后. 最后再向培养瓶中添加适量的完全培养基. 这样可以在干贴壁的阶段. 下面的完全培养基受热蒸发. 不断滋润"天花板"上的视网膜块. 使其不缺乏营养。
5. 干贴壁2－4小时后. 将培养瓶慢慢翻转平放. 继续静置培养。这一步最关键. 一定要慢慢的翻转. 使培养基慢慢漫过组织块. 而不使组织块飘起来. 一旦组织块飘起来. 就前功尽弃了。
6. 细胞融合后. 后续的细胞纯化可以采用差速贴壁法. 要是更好的. 就用流式分选或者磁珠分选。再后边的消化传代就和普通的细胞培养差不多了。
经验三十一
（1）实验技术大类：分子生物学
（2）具体实验技术名称： western blot
（3）实验对象：动物心肌组织/细胞蛋白
（4）简要步骤：凝胶配置及蛋白样品前处理
（5）心得体会：
1. 配胶: 该部分较为重要的是配制凝胶时要充分混匀. 此外应保证试剂的新鲜。
常出现的问题有：A. 凝胶出现花纹：此时应检查原料中过硫酸铵（AP）粉末是否受潮
B. 凝胶聚合时间较长：聚合时间由AP以及TE MED决定. 通常在30 Min左右. AP不新鲜会导致聚合变慢：此外还需注意环境的温度也很重要. 气温较低时胶是会凝得慢一些. 必要时可适当增加AP以及TE MED的量. 但通常不会超过1 h. 若超过1 h甚至更长仍未聚合. 应检查配制的操作有无错误。
2. 处理蛋白样品：该部分蛋白样品本身很关键. 若蛋白提取过程存在问题或蛋白发生降解则很难进行好之后的实验. 也就很难做出好的结果了；除此之外loadin g buffer的作用也不容忽视. 切莫使用不新鲜的上样缓冲液. 同时在处理时将样品与loadin g buffer混合均匀也应注意。
经验三十二
（1）实验技术大类：
形态学
（2）具体实验技术名称：
组织病理染色
（3）实验对象：
大鼠脑组织
（4）简要步骤:
1. 取材. 固定
用 10%水合氯醛(0. 33 Ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠后仰卧固定. 快速开胸. 暴露心脏. 直视下左心室插管入升主动脉. 同时剪开右心耳. 先以 0. 9盐水约 500 Ml 经升主动脉灌注冲洗后. 再灌注 4%多聚甲醛溶液(p h7. 500 Ml. 持续 2 h 后开颅取脑. 并将脑组织置于 4%多聚甲醛中浸置 4－6 h(4 ℃)后. 取视交叉后 4 M M 与小脑前之间的部分（相当于海马）及额叶的脑组织用 PBS 漂洗 4－5 h. 4 ℃冰箱过夜。
2. 脱水与包埋
将固定好的标本常规梯度乙醇脱水. 二甲苯透明后. 浸入加温融化的石蜡中浸透包埋. 制成蜡块。
3. 处理载玻片
将载玻片浸泡在温肥皂水中 2－4 h. 然后用自来水冲洗干净. 入 70 ℃烤箱烤干. 过酸. 再用大量自来水冲洗干净. 蒸馏水洗两遍. 入 70 ℃烤箱烤干. 泡在 95％酒精中. 用前取出载玻片. 用高压消毒的绸布擦拭干净. 涂 5μl0. 01％多聚赖氨酸（Poly-L-lycine. PLL）于载玻片上. 两玻片以推片方式涂开. 反复摩擦. 空气干燥. 4 ℃保存。
4. hE 染色
染色方法
①石蜡切片常规用二甲苯脱蜡. 经各级乙醇脱水：二甲苯（Ⅰ）5 Min→二甲苯( Ⅱ) 5 Min→ 100%乙醇 2 Min→95%乙醇 1 Min→80%乙醇 1 Min→75%乙醇 1 Min→蒸馏水洗 2 Min；
②苏木素染色 5 Min. 自来水洗 1 Min；
③盐酸乙醇分化 10－30s. 充分水洗；
④弱氨水反蓝 10－30s；
⑤自来水浸泡 15 Min；
⑥置伊红染液 20 Min；
⑦常规脱水. 透明. 封片：95％乙醇（Ⅰ）1 Min→95％乙醇（Ⅱ）1 Min→无水乙醇（Ⅰ）2 Min→无水乙醇（Ⅱ）2 Min→二苯甲石炭酸（3：1）1 Min→二甲苯（Ⅰ）1 Min→二甲苯(Ⅱ )1 Min→中性树胶封固。
（5）心得体会
1. 心得体会就是. 实验没有想象的那么难. 只要认真仔细. 就会得到预期的结果. 所谓付出才有回报。
2. 其实实验各个步骤的时间不是这样固定不变的. 要根据情况而定。
3. 盐酸乙醇分化 10－30s. 充分水洗；
④弱氨水反蓝 10－30s；
⑤自来水浸泡 15 Min；
⑥置伊红染液 20 Min；
这个步骤很关键. 分化好了. 片子对比度明显。
经验三十三
（1）实验技术大类：
形态学
（2）具体实验技术名称：
小鼠脾细胞（NK细胞）提取. 用于单克隆抗体的生物学活性检测
（3）实验对象：
小白鼠
（4）简要实验步骤：
1. 脱臼处死小白鼠. 75%酒精消毒
2. 腹部中央剪开皮肤. 用两把小镊子撕开皮肤. 暴露脾脏。
3. 取出脾脏置于盛有培养液的培养皿中。
4. 用小镊子于脾脏的粗短撕一小口. 用注射器吸好培养液从脾脏细短刺入. 冲洗. 反复几次. 直到脾脏变为浅色薄膜状即可。
5. 计数. 一个小鼠脾脏可以取出约10的7次方
我的心得体会：
该方法方便快捷. 取得脾细胞数量多质量好. 最可取的地方是避免了将脾脏切碎. 过筛. 手术视野非常干净。
经验三十四
（一）实验技术大类
细胞培养
（二）具体实验技术名称
大鼠肺动脉平滑肌细胞原代培养
（三）实验对象
SD大鼠
（四）简要步骤
用 5%水合氯醛经腹腔麻醉. 在超净平台内. 迅速剖开大鼠胸腔. 取出心肺组织。在解剖显微镜直视下取出肺细小动脉。用镊子刮3-5次除去内皮细胞。再经培养和胶原酶消化. 即可获得平滑肌细胞了。
（五）我的窍门或者心得体会
1. 大鼠事先放入配好的75%酒精中浸泡. 在超净平台中解剖进减少污染。
2. 去除内膜使用的镊子即可. 来回刮. 除去内皮细胞。
3. 去除内皮和外膜后. 置于20%FBS的D ME M培养液中2-3天. 得到更多的细胞。
4. 在0. 2%胶原酶I中消化时. 应经常地摇动. 有利于消化. 又可以仔细观察. 一举二得啊
5. 动脉消化后. 会有一些脱落的细胞和丝状或是一小块. 可以分开来养. 一个贴于培养皿中. 后一个置于培养瓶中。
6. 仔细观察细胞生长. 但是前2天千万不要去碰培养瓶. 不然细胞会脱落下来. 白养了。
经验三十五
（1）实验技术大类：
形态学
（2）具体实验技术名称：
Masson染色
（3）实验对象：
组织标本
（4）简要步骤:
1. 试剂配制
（1） Masson复合染色液
酸性复红 1 g
丽春红 2 g
桔黄 g2 g
0. 25%醋酸300 Ml
（2）亮绿染色液
亮绿SF 0. 1 g
0. 2%醋酸 100 Ml。
2. 染色步骤
中性甲醛液固定组织. 石蜡切片. 常规脱蜡至水。
（1） Masson复合染色液5 Min。
（2）0. 2%醋酸水溶液稍洗。
（3）5%磷钨酸5-10 Min。
（4）0. 2%醋酸水溶液浸洗2次。
（5）亮绿染色液5 Min. 0. 2%醋酸水洗2次。
（6）无水乙醇脱水. 二甲苯透明. 中性树胶封固。
3. 结果
胶原纤维呈绿色. 肌纤维呈红色. 红细胞呈桔红色。
（5）我的窍门或者心得体会：
（1） Masson复合染色液. 经磷钨酸分化时须用显微镜控制肌纤维清晰为止。
（2）亮绿染料可用苯胺蓝替换. 可用来作为对比观察染色的效果。
Masson不褪色小窍门(1)用比布列西猩红代替丽春红. 同时它与酸性品红之比由7∶3改为9∶1. 因比布列西猩红比丽春红与肌纤维结合更牢固。(2)使用磷钨酸与磷钼酸混合液作分化和媒染剂. 其浓度比原法加大了5倍. 分化和媒染时间15 Min. 比原法增加2倍. 有利于胶原纤维和苯胺蓝的牢固结合。以上两点因素. 可能就是促使切片不易褪色的原因。
经验三十六
（1）实验技术大类：
形态学
（2）具体实验技术名称：
培养细胞免疫组化
（3）实验对象：
细胞培养
（4）简要步骤:
1. 细胞爬片
将生长状态良好的细胞消化. 稀释至适当密度种于盖玻片上. 37 ℃培养箱培养。加入药物刺激一段时间后. 弃培养基. 冷的PBS洗3次. 加固定液于-20 ℃固定20分钟. 取出爬片. 自然晾干. 保存于-70 ℃备用。
2. 免疫组化染色(二步法)
（5）我的窍门或者心得体会：
1. 细胞爬片浓度要高 最好undefined10（6）
2. 节约就用盖玻片. 有钱就用nunc的培养盒（这个东西很贵. 不过效果很好. 可以同时做8个I hC. 不过也要800元. 贵啊！）如果用盖玻片. 一定要高温消毒. 并且分散放. 不然用的时候都沾到一起. 操作起来就容易污染
3. 丙酮固定效果好
经验三十七
1）实验技术大类：
生物材料
（2）具体实验技术名称：
微胶囊制备及稳定性研究
（3）实验对象：
枯草芽孢杆菌. 壳聚糖等
（4）简要步骤:
以明胶作为囊材
称取一定量的明胶用去离子水泡胀. 并于50 ℃水浴下溶解. 将0. 1 g枯草芽孢杆菌固体粉末加入到明胶水溶液中. 搅拌形成乳化分散体系。保持体系温度为50 ℃. 用10%醋酸溶液调节体系的p h为3. 5-3. 8. 然后向体系缓缓加入20%浓度的硫酸钠溶液[26]。
以壳聚糖为囊材
吸取1 Ml的乳化剂吐温80于含有100 Ml去离子水的烧杯中. 温度保持在50 ℃。称取一定质量的壳聚糖加入上述的烧杯中. 用10%的乙酸溶液溶解配置成溶液. 加入0. 1 g枯草芽孢杆菌固体粉末混合均匀[27]。
以海藻酸钠为囊材
吸取1 Ml的乳化剂吐温80于有100 Ml去离子水的烧杯中. 温度保持在60 ℃。称取一定质量的海藻酸钠加入上述烧杯中配制成溶液. 加入0. 1 g枯草芽孢杆菌固体粉末混合均匀 。
以黄原胶为囊材
吸取1 Ml乳化剂吐温80到烧杯中. 加入100 Ml去离子水. 温度保持在60 ℃。称取一定质量的黄原胶加入烧杯中配置成溶液. 加入0. 1 g枯草芽孢杆菌粉末混合均匀。
（5）我的窍门或者心得体会：
1. 壳聚糖. 黄原胶在溶解的时候水浴温度控制非常的重要；
2. 黄原胶在溶解的时候加的量非常重要. 如果量多很容易成团儿很难溶解；
3. 壳聚糖由于其分子量不同溶解的p h而不同. 一般在p h4左右。
经验三十八
（1）实验技术大类：
形态学
（2）具体实验技术名称：
免疫组织化学技术
（3）实验对象：
小鼠组织切片
（4）简要步骤: 即用型二步法
1）脱蜡. 水化组织切片。
2）根据所应用的一抗的特殊要求. 对组织切片进行预处理。
3）0. 3%或3% h2O2去离子水孵育5分钟-30分钟. 以阻断内源性过氧化物酶. PBS或TBS冲洗。
4）滴加一抗. 室温或37 ℃孵育30~60分钟. 或4 ℃过夜. PBS或TBS浸洗3分钟×5次。
5）滴加en han gcer增强剂. 37度30 Min. PBS或TBS浸洗3分钟×5次。
6）滴加通用型I g g抗体-Fab段- hRP多聚体. 室温/37 ℃孵育30分钟-1 h. PBS/TBS冲洗. 3分钟×5次。
7）应用DAB溶液显色。
8）蒸馏水冲洗. 复染. 脱水. 透明. 封片。
（5）我的窍门或者心得体会：
1. 方法操作不难. 最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理. 每一步知道为什么这样做. 这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度. 温度. 时间. 这三者一般是相互成反比的（相对）. 其中浓度是最重要的先决条件. 温度决定反应的速度. 时间决定反应的量。就拿温度来说. 可以有4度. 室温. 37度. 我推荐4度最佳. 反应最温和. 背景较浅；而37度反应速度较快. 时间较短；室温我不太提倡. 除非你每次都把环境温度控制在一定的范围. 否则. 尽量选择前两者。
2. 免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法. 免疫组化具有定性灵敏度高. 定位较直接准确. 是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。
3. 免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析. 但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下. 分析最为准确. 这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。
4. 免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应. 其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。
5. 免疫组化的应用广泛. 是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时. 明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难. 加一些形态学数据或图片. 老外十分欢迎. 可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。
6. 免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件. 浓度. 方法步骤. 重复运用于同一性质的切片和同一种抗体. 做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法. 更换一种抗体后. 居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程. 成功有时也加快你自傲。
7. 实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那. 这是因为我经过了反复的动手+动脑. 把理论原理运用于实践. 在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决. 最终把理论与实践融会贯通。
经验三十九
（1）实验技术大类
形态学
（2）具体实验技术名称
大鼠脑脊液的抽取
（3）实验对象
大鼠
（4）简要步骤
位置：大鼠的小脑延髓池
器械：1 Ml注射器
步骤：麻醉后项部备皮（备干净）. 消毒后进针. 有落空感停针. 慢慢抽取。抽完后老鼠仰卧. 回笼饲养。
ps：如果抽不出来. 还可以选择麻醉后将小鼠颈部的皮肤肌肉切开. 暴露环枕膜. 再抽. 然后缝肌肉缝皮肤. 回笼饲养。
（5）我的窍门或者心得体会
强调手感. 那个落空感要求胆大心细手要稳。多练几次就可以了。
经验四十
（一）实验技术大类：
细胞培养技术
（二）具体实验技术名称：
外周血单个核细胞提取
（三）实验对象：
外周血
（四）简要实验步骤外周血单个核细胞的获取
1在15 Ml离心管中加入2 Ml淋巴细胞分离液。
2取肝素抗凝静脉血与等量PBS充分混匀. 用滴管取混匀后外周血沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液液面上. 置离心机离心2 000 rp M×20 Min。
3离心后. 离心管内分为三层. 上层为血浆和PBS液. 下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液. 在上层中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层. 为淋巴细胞和单核细胞和少量血小板的混合物。
4用1 Ml吸管插到云雾层. 吸取单个核细胞。置入另一15 Ml离心管中. 加入5倍以上体积的PBS. 1 500 rp M×10 Min. 洗涤细胞两次。
我的心得:
第2步. 一定要缓慢添加. 因为密度的关系. 单个核细胞一旦下沉. 就上不来了
吸取云雾层时. 务必小心. 可以用弯头的吸管. 这样利于操作.
经验四十一
（1）实验技术大类：
细胞培养之细胞增殖检测方法
（2）具体实验技术名称：
MTT
（3）实验对象：
肿瘤细胞
（4）简要步骤:
1）取对数生长期的肿瘤细胞. 0. 25%胰酶消化. 含10%新生牛血清的PR MI1640培养液悬浮细胞. 制成单细胞悬液. 调整细胞浓度为1. 5×104个/ Ml. 96孔板每孔中加入200 ul. 细胞的边缘孔用无菌PBS填充。
2） 37 ℃. 5%CO2培养箱中培养过夜. 无血清PR MI1640培养基饥饿细胞24小时。
3） 细胞培养液换成含1%新生牛血清的PR MI1640培养液200 ul. 并加入不同的干预因素. 每个浓度组设5个复孔。
4） 37 ℃. 5%CO2培养箱中孵育……小时。
5） 每孔加入10 ul MTT溶液. 继续培养4小时. 小心地吸尽每孔中的液体. 每孔再加入D MSO100 ul. 摇床上震荡10分钟。
6） 然后在酶标仪波长490n M处. 参比波长630n M处读取每孔的吸光值A。
（5）我的窍门或者心得体会：实验中种板子非常重要. 种的不均匀可能影响最后的结果. 本人刚开始在丁香园上学到一种方法. 就是种过细胞后. 用手将96孔板平拿起. 左右晃动几下. 然后再前后晃动几下. 最后在显微镜下看总有几个孔的细胞分布不均匀. 最后用一种比较好的方法就解决了这个问题. 如下. 先用抢将吹打均匀的细胞吸起来. 让后将枪头紧贴着孔的一侧壁（注意枪头的尖不要接触孔底）. 然后将枪头中的细胞缓缓的打下去. 种好之后千万不要摇晃板子. 直接放到显微镜下看就可以了. 此方法可以说是100%的有效吧。
经验四十二
（1）实验技术大类：
形态学
（2）具体实验技术名称：
骨组织免疫组化
（3）实验对象：
人股骨头骨组织
（4）简要步骤:
1. 标本常规10%甲醛固定后7%硝酸脱钙。
2. 常规脱水包埋切片5u M厚.
3 1）脱蜡. 水化；
2）PBS洗2～3次各5分钟；
3）3% h2O2（80%甲醇）滴加在T MA上. 室温静置10分钟；
4）PBS洗2～3次各5分钟；
5）抗原热修复；
6）PBS洗2～3次各5分钟；
7）滴加正常山羊血清封闭液. 室温20分钟。甩去多余液体。
8）滴加Ⅰ抗50μl. 4 ℃过夜。
9）4 ℃过夜后需在37 ℃复温45分钟。
10）PBS洗3次各5分钟；
11）滴加Ⅱ抗40～50μl. 37 ℃1小时；
12）II抗中可加入0. 05%的t ween-20。
13）PBS洗3次各5分钟；
14）DAB显色20到40秒. 在显微镜下掌握染色程度；
15）PBS或自来水冲洗10分钟；
16）苏木精复染10到20秒. 盐酸酒精分化；
17）自来水冲洗10～15分钟；
18）脱水. 透明. 封片. 镜检。
（5）我的窍门或者心得体会：
骨组织免疫组化最容易出现的问题是脱片. 我在试验过程中不断总结摸索. 找到一些小窍门：
1）骨组织脱钙一定要脱到位（方法很多）. 一定要把组织脱软。如果脱钙不到位就更容易脱片。
2）载玻片的处理也很关键. 我是把玻片洗干净后酒精泡24小时. 多聚赖氨酸按1:5的比例配置涂片三遍. 多聚赖氨酸的浓度小了也很容易脱片的.
3）骨组织免疫组化脱片最常见的环节就是抗原热修复时. 我先用微波修复时脱片很明显（可能是微波修复时枸橼酸沸腾不断的冲击玻片把组织冲脱）. 后来改用电磁炉煮沸修复（先把电磁炉上水盆中的水煮沸. 然后把盛有枸橼酸修复液的烧杯放入盆中. 这样盆中的水沸腾时烧杯中的枸橼酸液就不会沸腾. 但是通过传导烧杯中的枸橼酸液也会达到修复温度的. 可以用温度计量温）. 通过这种方法后脱片就明显减轻了。
经验四十三
（1）实验技术大类：
细胞生物学
（2）具体实验技术名称：
细胞培养中细菌污染的处理
（3）实验对象：
非小细胞肺癌A549细胞
（4）简要步骤:
1. 高倍镜下发现平均每视野有1~2个细菌（如细沙状. 有自主运动）。再多的话就弃去吧。
2. 吸弃细胞培养液. 用加温温度接近36摄氏度的pbs缓冲液冲洗数遍。
3. 换用浓度1万 U/ Ml的青. 链双抗+培养基. 置于培养箱中。约30 Min。
4. 吸弃液体。再改用500 U/ Ml的青. 链双抗培养1~2天。
5. 换用正常培养基
（5）我的窍门或者心得体会：
1. 温度. 所有液体尽量要保证温度接近36摄氏度。否则对细胞伤害太大。
2. 在用1万 U/ Ml的青. 链双抗的时候. 要隔几分钟看下细胞。要是细胞有变圆的情况。立刻换用低浓度青. 链双抗的培养基。
3. 仅在紧急情况. 也就是细胞丢不起的情况下使用。基本能保证细胞5~6天寿命。
经验四十四
（一）实验技术大类
细胞培养
（二）具体实验技术名称
乳鼠心肌细胞原代培养
（三）实验对象
SD大鼠(2-3天)
（四）简要步骤
取出生3天的SD大鼠. 取其心室部分剪成小块. 将其转入装有0. 1℅胰酶消化液中37?C分次消化(每次10分钟)3次。收集每次消化后的上清800r/ Min离心10 Min. 弃上清. 用含有20％胎牛血清的D ME M液悬起沉淀。按需要调整细胞数。采用差速贴壁法纯化。用台盼蓝染色观察细胞成活率。将成活的心肌细胞放入培养液于37 ℃. 5％CO2进行培养。24小时后心肌细胞贴壁并开始搏动. 72小时后细胞伪足展开。
（五）我的窍门或者心得体会
1. 乳鼠越小效果越好. 如出生1-3天的效果最好.
2. 酶消化. 大家都不会有问题. 但消化后的反复吹打才是心肌细胞收集的关键一步. 我开始的试验总不能成功就与吹打有关.
3. 消化后一定要要用吸管吹散细胞. 做得好的时候. 可以看见整个液体变混浊. 终止消化. 再离心收集细胞. 放置培养瓶.
4. 静置培养凭24小时就可以看到细胞贴壁. 24-48小时会有细胞搏动. 以后细胞搏动频率增快. 可以进行各项干预.
6. 我试验感到一定要用胎牛血清. 20%是合适浓度.
经验四十五
（1）实验技术大类：
实验动物模型建立
（2）具体实验技术名称：
水合氯醛麻醉
（3）实验对象：
大鼠
简要实验步骤：
本人所做的模型需要使用水合氯醛麻醉. 所使用的是医院里配制的用于儿科灌肠的10%水合氯醛。在先前的实验中. 剂量为0. 3 Ml/100 g（这个剂量来自于本人师姐使用的经验）. 麻醉完全清醒时间约4 h（当初没有记录开始清醒的时间）。
现在由于实验方案有所改动. 希望麻醉的时间尽量缩短（1-1. 5 h）. 而麻醉深度保持不变. 这样在侧脑室注射操作后. 大鼠能够尽快的恢复清醒状态. 便于后续的实验操作。因此. 对水合氯醛麻醉的剂量与药效进行了摸索. 我把它贴出来. 跟大家分享一下。
动物：雄性SD大鼠4只. 平均体重356 g（这里就不算标准差了）. 水合氯醛浓度分为4%. 7%. 10%三个水平。
结果如下：
水合氯醛浓度 4% 7% 7% 10% 10%
水合氯醛剂量 0. 5 Ml/100 g 0. 3 Ml/100 g 0. 2 Ml/100 g 0. 2 Ml/100 g 0. 3 Ml/100 g
诱导时间 约7 Min 约4 Min 约7 Min 约4 Min 约4 Min
麻醉深度 浅麻醉水平 中度麻醉 浅麻醉 深度麻醉 深度麻醉
麻醉开始清醒时间 约90 Min 约100 Min 未观察 约68 Min 114 Min
结论：
1. 麻醉的诱导. 似乎从4%到（7%. 10%）. 随着浓度的增加. 麻醉 诱导的时间缩短。但在7%及10%这两个浓度. 麻醉时间基本一致。
2. 麻醉时间的长度与水合氯醛的总剂量可能成正相关。
3. 麻醉的深度跟与水合氯醛的浓度可能成正相关
在之前甲醛《做动物实验前必须给予阿托品吗？》的这篇帖子中. http:// w w w. dxy. cn/bbs/post/vie w?bid=156&id=12524218&sty=1）. 有战友提出"把水合氯醛配成4%的. 而不是10%的. 这样就拉开了麻醉剂量和致死剂量之间的差距. 可安全了". 我的经验或者心得体会是：
（1）确实. 4%的水合氯醛在实验中比较安全. 我们一般用于追加麻醉的时候. 4%水合氯醛每次1 Ml. 追加一到两次. 安全度颇高。
（2）而水合氯醛的致死剂量. 我不是很了解. 希望知道的战友能够告知一声。对于10%的水合氯醛. 我们用到0. 3 Ml/100 g也很安全. 应该距离致死剂量还有一段距离. 麻醉深度与维持时间也很确切。
（3）据我认识的一位在伦敦大学获得博士学位的解剖学的教授介绍. 英国人喜欢用7%的水合氯醛0. 5 Ml/100 g. 我看过他的博士论文也是用的是这个剂量。
由于样本量太小以及存在动物本身的个体差异. 以上结果与结论科学性以及说服力有很大的欠缺。但是. 当成实验的心得体会交流. 应该也有一定的参考价值。欢迎大家分享关于水合氯醛使用的心得。
经验四十六
（1）实验技术大类：
形态学
（2）具体实验技术名称：
电镜组织包埋
（3）实验对象：
大鼠视网膜
（4）简要步骤:
1. 常规固定大鼠. 冰上取眼球. 剪除角膜. 玻璃晶状体. 将视杯置于事先配好的电镜后固定液中. 4 ℃过夜；
2. 取出组织置于0. 1 MPB中. 剥离视网膜. 取一小块目的组织；
3. 0. 1 MPB洗15 Miundefined3次
4. 1%OsO4染色 1. 5 h
5. 2%醋酸铀染. 15 Min. 0. 1 MPB洗15 Miundefined3次
6. 梯度丙酮脱水(50% 70% 90% 95% 100% 100%各10 Min)
7. 脱水后的组织. 用预包埋剂覆盖. 干燥器内过夜
8. 在包埋板中包埋组织. 做好标记. 干燥器内2小时；
9. 放入60 ℃烤箱. 3-5d即可
（5）我的窍门或者心得体会：
丙酮脱水换丙酮速度要快. 最好有两个人. 一人吸出. 一人添加. 勿使组织干掉；包埋前组织很脆. 易碎. 动作要轻
（1）实验技术大类：
形态学
（2）具体实验技术名称：
冰冻切片时组织形态的保持
（3） 实验对象：
小鼠皮肤组织
（4）简要实验步骤
组织经4%多聚甲醛固定后. 30%蔗糖沉底。然后OCT包埋. 切片. 裱片。
众所周知. 冰冻切片方便. 省时。但是对于有严格形态要求的组织来说. 如皮肤. 小肠等. 由于冰冻切片机不能调节组织块方向. 所以是不容易切出较好的形态的。针对这个问题. 我有以下心得体会：
1. 在组织取材的时候. 就要严格按照组织方向来修剪. 并且组织块不宜大. 这样会影响固定. 脱水效果. 切片时会出现烂片的现象。
2. 组织包埋前将水分吸干。一手用镊子轻轻靠住组织. 使其保持竖直方向. 另一只手滴加OCT。底部开始. 避免气泡. 然后逐渐向上. 包埋面积也逐渐减小。包埋过程在冰冻切片机内进行. 这样能够保持OCT快速冷凝. 利于维持组织方向。
经验四十七
（1）实验技术大类
实验动物模型建立
（2）具体实验技术名称
双侧海马置管
（3）实验对象
SD大鼠（280 g 左右）
（4）简要步骤
1）大鼠腹腔注射50 M g的5%戊巴比妥纳麻醉。
2）翻正反射消失后将其固定于脑立体定位仪。
3）75%酒精消毒. 备皮. 再次碘伏消毒。
4）大鼠腹腔注射5万单位的青霉素钠（生理盐水溶解）. 预防术后感染。
5）切皮. 暴露颅骨. 钝性剥离骨膜. 暴露前囟及人字缝。
6）在立体定位仪指导下确定置管的位置（定位：前囟后3. 4 M M. 左右旁开1. 7 M M. 深2. 7 M M. 门牙列水平距耳间线-3. 3 M M）。
7）颅骨上钻孔. 固定锚定螺丝. 在先右后左依次放置不锈钢套管. 骨水泥固定。
8）待骨水泥凝固. 彻底止血后缝合皮肤。
9）放置内芯. 防止套管堵塞。
10）75%酒精消毒伤口. 大鼠单笼饲养一周。
（5）我的窍门或者心得体会
1）摸索麻醉浓度及剂量. 不适当的深浅麻醉均可能导致手术过程中狼狈。
2）两人合作. 一个负责台上（无菌）. 一个负责台下（相当于手术室中的巡回护士一角）. 否则一旦出现感染则损失巨大（整个模型报废. 或导致后续实验数据失真）。
3）术后给予大鼠营养支持. 后续试验前3-5天需每天抚摸5分钟. 建立兄弟般情意. 否则它不会安静的配合你通过那个小小的套管给药。
4）每天观察内芯是否还在. 否则套管内血块或肉芽形成堵塞套管。
经验四十八
（1）实验技术大类：
实验动物模型
（2）具体实验技术名称：
大鼠脓毒血症实验动物模型
（3）实验对象：
SD大鼠
（4）简要步骤:
0：术前夜禁食不禁水；
1. 称重；
2. 麻醉（2% 苯巴比妥钠. 40 M g）；
3. 剃毛. 酒精消毒；将大鼠仰卧在泡沫垫子上；
4. 在正中偏左切口做一个2c M切口. 用手术刀切开后. 再用剪刀延长切口进入腹腔；
5. 确认腹白线. 在肌肉间作切口. 切开筋膜和腹膜；
6. 用镊子取出盲肠. 不要损伤系膜动脉. 大部分情况下. 盲肠在左侧腹腔；
7. 小心分离盲肠系膜. 避免损伤动脉引起出血；
8. 在预定的位置结扎盲肠. 确认没有结扎回盲瓣.
9. 先将盲肠内容物轻柔地挤到远端盲肠. 然后在结扎盲肠中部穿孔2次；
10. 将针抽出后. 两侧挤出少量的粪便. 确保每个动物的量一样；
11. 将盲肠回纳腹腔. 不要将粪便留在伤口边缘；
12. 分层关闭切口. 碘伏消毒。
13. 皮下注射37度温水5 Ml复苏. 大鼠回笼. 自由饮食饮水。
（5）我的窍门或者心得体会：……
1. 盲肠结扎穿孔的大鼠脓毒血症模型. 比较经典。做起来也不是特别的复杂。但是很多细节还是比较注意。
2. 术前禁食一夜. 但不禁水。
3. 因为要为了保证模型的稳定性. 必须保证每只大鼠的结扎位置一样. 而且穿孔的位置也比较固定. 我们结扎是结扎50%的中等程度。
4. 挤出的粪便千万不能大多. 感觉这个的影响很大. 只需要看到穿孔处稍微有一点即可。
5. 术后给予一定的液体给予复苏。
