DNA序列和大规模DNA测序策略的探讨

人类基因组计划的核心内容之一是基因组测序。随着人类基因组图谱趋于完成，人类基因的定位克隆、鉴定分析直至全基因组测序取得了突破性进展，测序策略的成熟、测序方 法的改进、自动测序仪的广泛应用、计算机数据分析系统的扩展以及测序分析能力的提高， 大大推进了大规模DNA测序的进程。

第一节 DNA测序的基本方法

一、Maxam-Gilbert的化学降解测序法

①先用限制性内切酶把DNA切成10―200bp 的测序材料，②用碱性磷酸化酶处理该片段，消除5′末端上的磷酸，③在5′OH端标记32 P，用多核苷酸磷酸激酶催化，④标记片段变性为单链，⑤化学试剂在特定碱基位置降解单链DNA， 产生一组长度不等的DNA片段，⑥经电泳和放射性自显影后，从4个反应系统统一阅读， 待测DNA的全部核苷酸序列就可直接读出。

二、Sanger的酶降解测序法(链终止法)

这项技术的关键是在DNA的聚合过程中依赖特殊反应底物(2′3′―双脱氧核苷三 磷酸ddNTP)的特异性终止进行DNA测序。

第二节 DNA测序的策略

一、定向测序策略

定向测序策略是从一个大片段DNA的一端开始按顺序进行分析 。传统的方法是用高分辨 率限制酶切图谱确定小片段的排列顺序，然后将小片段亚克隆进合适的克隆载体并进行序列 分析。

二、随机测序战略

随机测序战略又称鸟枪战略(shotgun strategy)，此策略是将人类基因组DNA用机械方法随机切割成2Kb左右的小片段，把这些DNA片段装入适当载体，建 立亚克隆文库，从中随机挑 取克隆片段。最后通过克隆片段的重叠组装确定大片段DNA序列。

三、多路测序战略

多路测序战略(Multiplex method)是鸟枪法的一种发展策略，是通过多个随机 克隆同时进行电泳及阅读，快速分析DNA序列的一种技术。这种方法的复合随机克隆文库来源于相同的基因组DNA。将 DNA片段克隆到20种不同的质粒载体上，再亚克隆进不同的质粒载体。将来源20个亚克隆库的克

四、聚合酶链式反应(PCR)

反应程序包括三个步骤：(1)DNA双链加热(94℃)变性成单链 ；(2)加入两种DNA单链引物，分别与两条模板链退火(55℃)；(3)DNA聚合酶从两引物的3′ 端按模板要求合成新生DNA链(72℃)。重复操作，可使DNA快速扩增，20个循环后可使模板DN A 扩增1万倍，30个循环后可使模板DNA含量放大100万倍，只需2个多小时的时间。