重组胰蛋白酶最适 PH 和 PH 稳定性
雅心
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样品：重组胰蛋白酶，比活 4500USP u/mg pro.，上海雅心生物技术有限公司，纯度如图 1 所示。BAEE，Sigma.
图 1. 重组胰蛋白酶的纯度的 SDS-PAGE 鉴定
1. 最适 pH 的研究
准备 pH 为 3~12 的底物 BAEE（0.25 mM），分别测定 rPT 纯酶液的活性，最后结果表示为测定数值占最高酶活的百分比。缓冲液成分依次为 25 mM NaAc-HAc (pH 3~6)，25 mM Tris-HCl (pH 7~8)，25 mM Gly-NaOH(pH 9~12)，所有缓冲液均为 25℃ 下配制。底物在 25℃ 温浴 10 分钟后，开始测活。
2. pH 稳定性的研究
取活性为 10 mg/ml 纯酶液，分别在 pH 3~12 缓冲液中稀释 10 倍，在 25℃ 下温浴 2 h，取样品测定酶活，以水浴前酶液初始活性作为 100%，计算残余活性。缓冲液依次为 25 mM NaAc-HAc (pH 3~6)，25 mM Tris-HCl (pH 7~8)，25 mM Gly-NaOH (pH 9~12)，所有缓冲液均为 25℃ 下配制。
图 2. a, RPT 最适 pH 曲线； b, RPT 的 pH 稳定性
分别在 pH 3.0~12.0 不同的 pH 条件下，测定 rPT 活性。结果见上图 2a，最适 pH 范围是 7~11，而 pH 为 9.0 时测得 rPT 活性为最大值，这与天然提取的猪胰酶不同（天然胰酶最适 pH 为 7.6-9.0），几乎接近极值，确定该值为测活最适条件，但是底物在碱性条件易降解，所以底物尽量要现用现配。
分析不同 pH 环境对 RPT 活性的影响，如图 2b 所示，rPT 在 pH 3.0 NaAc-HAc 缓冲液里最为稳定。随着 pH 的升高，RPT 酶活的损失程度也随之提高。在测定 rPT 最适 pH 值时发现，pH≤5 底物条件下，RPT 蛋白几乎无活性，如图 2a 所示。在 pH≤5 的缓冲液中，2 小时后依然保持较高的活性。
说明在 pH≤5，RPT 稳定，自降解的速率大大降低，酶分子处于相对稳定的状态。此时把酶液转入到 pH 7.6 的测活体系中，此时酶分子的构象瞬间发生变化，重新暴露出活性位点，于是又恢复了活性。此外，RPT 对碱性环境有一定时间的耐受性，在 pH<9环境中，2小时后依然有80% 以上的酶活残余，从这一点讲，rPT扩大了胰酶的应用pH范围，有很大的意义。但是pH>10 环境中，活性损失非常快。
