正常角膜内皮细胞培养
互联网
5011
实验材料：
1. 角膜材料：可以取自人眼、兔眼或者牛眼，人眼材料最好来自胎儿；
2. 清洗液：不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素，pH7.2；
3. 特殊器械：虹膜恢复器；
4. 消毒液：1：5000的升汞溶液与100IU/ml的庆大霉素生理盐水；
5. 消化液：0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA混合溶液；
6. 培养液：基础液由DMEM培养基加入HEPES 6.0g/L、NaHCO3 2.2 g/L以及L-谷氨酰胺0.06 g/L配制而成。应用液是在基础液内补加15%的胎牛血清、青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml，并用5% NaHCO3 调节pH至7.0—7.2。
实验方法：
1. 切取角膜内皮层组织：
以人眼为材料培养角膜上皮细胞时，最好取自胎儿的眼角膜。因为成年人眼角膜细胞在体外培养时，生长活力不如胎儿眼角膜细胞；
①摘取眼球1只，用升汞溶液与庆大霉素生理盐水消毒液交替冲洗2次，以洗去眼球表面残留的血污并作初步消毒处理；
②无菌条件下，于角膜缘内侧1mm处作一环形小切口；
③ 用虹膜恢复器从切口处插入后弹力膜与角膜基质（实质层）之间，顺角膜弧度钝性分离去除整个角膜实质层；
④待角膜上皮层被完全分离之后，沿角巩膜缘内侧1mm处环形剪下全周内皮层组织。
2. 接种与培养；
①将所取的内皮层组织放在培养皿中，加入2—3滴牛血清；
②用角膜剪将其剪成约1.5mm×1.5mm大小的组织块；
③用无齿小镊子将组织块内皮面朝下平贴接种于培养瓶中；
④在培养箱中静置20—60min，待植块牢固黏附后，再加入足量培养液；
⑤按常规方法培养，每周换液2次。
