试管婴儿植入前遗传学诊断单细胞PCR的方法

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)简称PCR技术，是近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术，由于其可使特定DNA片段在数量上呈指数增加至可检测范围，故成为基因诊断的重要方法。

在PCR基础上衍生的一些扩增技术已用于基因突变的诊断。目前单基因疾病PGD所用的方法主要是基于PCR技术通过检测单细胞靶基因的数目及结构有无异常加以诊断。

聚合酶链式反应

PCR实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。

基本原理是：用一对寡核苷酸链做引物，引导DNA聚合酶在引物识别位点之间两条互补链上进行DNA合成，经过模板变性、退火及延伸三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，多次循环可使特定DNA片段在数量上呈指数增加至2×l0(6一7)拷贝。

单细胞PCR无需抽提DNA，经过变性前处理步骤后，即进行PCR循环反应。与经典PCR相比，其优点是无需制备DNA，节省时间，从获得样本、PCR反应到出结果只需几个小时左右。但由于单细胞PCR的模板量极低，仅1–2拷贝，故PCR体系必须具备下列条件：

①对模板扩增的忠实性好；

②方法稳定；

③无非特异性扩增；

④扩增的灵敏度高。目前用于PGD的PCR方法主要有以下几种：

1．巢式PCR

由于单细胞中可检测的仅l一2个拷贝的基因序列。

为了既不影响特异性又获得较大的敏感性，巢式引物被应用。巢式PCR设置二步PCR，只有初级PCR中特异的扩增片段才可能被二级引物扩增，可减少引物与模板非特异性位点的复性、引物二聚体的形成以及非特异背景产物的产生，从而提高了扩增特异性，而且增加了最终产物量。

2．多重PCR

如果与疾病相关的基因十分庞大，如杜氏肌营养不良症(DMD)，有2000多kb长。这些基因常多处发生缺失或突变，而且这些改变发生在相邻十至数百个kb的距离，超出了PCR技术所能扩增的有效长度，对此，可采用多重PCR，既在同一试管中加人多对引物，扩增同一模板的几个区域。目前报道多重PCR反应最多可同时扩增12条区带。

3．荧光PCR

指荧光标记的寡核苷酸引物。PCR产物用激光分析系统进行分析，从产物大小到核苷酸序列都能够被准确分析。由于不同的荧光分子在激光激发下有不同波长，在片段分析结构系统中，相同大小的不同产物可以被区分开。

其敏感性优于普通PCR千倍。准确性可达l一2bp。对于单细胞35–4O个循环就可以产生足够量的产物，不仅减少了散在的、非特异的污染，而且缩短诊断时间。现该方法已广泛用于PGD。

4．荧光定量PCR

该技术融汇了PCR和DNA探针杂交技术的优点，反应体系中，不仅有两条普通的引物，还有一条荧光标记探针。这条探针的5’和3’端分别标记了荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)。当探针保持完整时，无荧光发出。

PCR开始后，随着链的延伸，Taq酶将荧光探针切断，释放出荧光信号，且信号的强弱与PCR的产物数量成正比，检测出前者可计算出后者，从而获取DNA模板的准确结果。

该技术在完全闭管的情况下进行，无需凝胶电泳，通过特殊探头直接探测PCR过程中荧光信号的变化，解决了常规PCR不能定量及扩增产物污染而导致的假阳性、操作复杂等问题，减少污染的可能性，提高了诊断的效率。

5．原位PCR

此技术由HaSSe等于1990年建立，即在固定于同一载玻片上的同一个单细胞上，先用PCR原位扩增，再用FISt{检测，目前PGD中应用该方法，PCR的有效率为65％，FISI–I达85％。遗憾的是ADO较常规PCR高。

但这种新方法有效的把原位杂交技术的细胞定位能力与PCR扩增的所有潜在敏感性结合起来，相信随着引物设计及荧光PCR与原位PCR有效的结合，其不足会得到克服，该方法也许会成为PGD的未来。

6．免疫PCR

是PCR法与酶联免疫吸附试验(ELISA)法的融合技术，利用了PCR的大量扩增能力和抗原抗体反应的特异性。

其原理是将目的基因的扩增产物用生物素标记，检测突变的特异性探针用地高辛标记，二者经变性退火处理后加到含抗生物素的酶标板内，通过显色来鉴定突变是否存在。根据显色深浅可做定量分析。该法已用于囊性纤维病基因突变的检测。

7．等位基因特异性扩增

在设计引物时，根据已知突变位点的特征，在引物3’端或中间设计一错配碱基，使之仅能与突变型或野生型基因互补，而只扩增相对应的突变型或野生型基因。主要用于点突变导致的遗传病的检测。其优点是只需一步PCR，而无需电泳和标记，摆脱了分子生物学方法中必经电泳的现象。

在相互竞争的突变型和野生型引物中，分别采用不同荧光染料标记扩增的DNA，可直接对扩增产物进行判读。另外使用具有特定酶切位点的内嵌引物，也可提高产物特异性和产量，DNA扩增后用酶切割，由酶切产物可明确是否有基因突变，该法已应用于单个精子的DNA分析。

8．全基因组扩增技术

PGD的难点之一是可检测的材料极为有限，通常仅l一2个卵裂球细胞，约15–30pg的基因组DNA，很难进行一个基因的多种突变或多位点基因的改变的基因分析。全基因组扩增技术建立和成熟对PGD的开展具有重要的意义。

主要有引物延伸前扩增和简并寡核苷酸引物PCR两种方法。它能够无选择偏移的扩增全部DNA序列，从理论上讲，任何基因都能从全基因组扩增产物中检测出，可用于多个突变位点的单基因病、多基因病的诊断及染色体组分析等。

9．微卫星DNA的PCR  多基因遗传病和先天畸形，目前其易感基因研究常用的遗传标记是微卫星标记。微卫星DNA(miCrosatcllite DNA)又称简单重复序列(Sim–pierepcned scquence，SRS)，能参与遗传物质的结构改变、基因调控，是基因重组和基因变异之源。脆性X染色体综合征、强直性肌营养不良、脊髓小脑共济失调等遗传性疾病都与之有关。该方法已用于脆性X染色体的PGD。此外，微卫星DNA多态性的特点可以用来分析单细胞DNA扩增产物的来源及纯度。通过检测进行PGD的双亲的STR等位基因的大小，估计合子的类型。任何可能性之外的基因型都提示存在污染，包括来自母体细胞的污染。这种方法同样也可以发现单体型及同一来源的二倍体。对反复发生的葡萄胎有诊断价价值．

l0．RT–PCR  单基因疾病植入前诊断误诊的原因很大程度上是由于仅有单个DNA拷贝导致扩增失败或污染以及等位基因脱扣。RNA分析如果已知某种与遗传病有关的基因在体外培养期间确实已开始表达，那么将致病基因表达的mRNA反转录成cDNA，对cDNA进行扩增，来检测目的基因，所需的底物拷贝数相对较多，有可能解决单个DNA拷贝对植入前诊断发展的限制。目前已将该法应用于Marfan氏综合征患者的PGD。

二、单细胞经上述PCR后主要有以下几种方法进行基因诊断

1．根据特异性扩增带做出诊断  这主要对于基因缺失引起的疾病有重要意义。如α一地中海贫血等诊断。根据扩增片段长度的不同可以区分正常组与异常组。此外，为排除PCR反应体系不适造成的假阴性，应在同一反应体系中加入另一对引物扩增其他非缺失序列作为内对照。

2．限制性酶谱直接分析法  限制性内切酶具有识别DNA中特定核苷酸顺序，如某种限制性内切酶，其切点在被检测基因内或外围，酶切后该基因存在于特定长度的片段中，在正常情况下所切出的片段长度是固定的，当基因发生突变后，核苷酸顺序发生改变，就可导致限制性内切酶的酶切位点改变，切点消失或产生新切点，从而使片段大小也发生改变。PCR后，用限制性内切酶切PCR产物，根据电泳后酶切片段长度的变化，即可做出诊断。适用于已知点突变遗传病、基因缺失及基因增加或大片段插入等遗传病的诊断。

3．限制性片段长度多态连锁分析法  指在人群中用同一限制性内切酶消化基因组DNA，可产生不同长度的DNA片段，称为限制性片段长度多态(RFLP)，按孟德尔规律遗传，目前大多数单基因病的基因结构、基因产物以及突变性质等都还不完全清楚，不可能用直接法诊断，这类遗传病可在致病基因附近寻找一个或几个与基因相连锁的DNA多态作为特定遗传标记，通过先证者及其家系成员的分析，但父母必须是RFLP杂合子，就可间接判断致病基因的存在与否，既间接诊断，故称RFLP连锁分析间接诊断。

4．寡核苷酸探针一一斑点杂交检测法  适用于任何已知点突变性质的遗传病，特别是具有遗传异质性的遗传病，如s地中海贫血。方法为针对已知的点突变，合成一对寡核苷酸探针cleotide．probe)，一个为正常基因片段与相应正常序列完全互补；另一个为突变基因片段，与相应的突变基因完全互补。探针经标记后与经PCR扩增后的扩增产物进行斑点杂交，就可直接显示突变基因是否存在，直接做出诊断。早期寡核苷酸探针一一斑点杂交，是先将待检测DNA或PCR产物固定在尼龙膜上，再与寡核苷酸探针一一斑点杂交，但每次只能检测一种突变。后来发展的反向点杂交(re–verse dot blot，RDB)，是将生物素标记的寡核苷酸探针固定在尼龙膜上，再与PCR产物杂交，一次可检测多种突变，大大提高了诊断效率。

5．单链构象多态性(SSCP)  是一种筛选方法，在l00一500个碱基对中只有一个碱基对的异常时，它也可以发现。在PCR过程中产生的单链，通过链内的相互作用会产生序列特异性形态。一个碱基对的变化就可以使DNA单链显示出根本不同的形态，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中会显示不同的条带，从而可以区分正常及异常等位基因。由于有多点突变的复杂杂合子会呈现特异的条带而得以诊断。SSCP是最常用的基因突变诊断方法。因所需仪器设备较少，步骤简便，价格便宜，可以用溴化乙锭或高敏感性的银染的方法代替放射性同位素等优点使SSCP得到广泛应用。但所选的凝胶会影响单链的迁移，从而影响实验结果，温度也是影响因素之一。不同的单链有不同的适宜温度。因此，有可变的凝胶系统是很重要的，可以为不同的突变选择不同的最佳温度。SSCP异源DNA链分析可共同用于家族性结肠息肉的植入前遗传学诊断。因为这两种方法所用凝胶相似，所以可以同时应用。

6．变性梯度凝胶电泳(DGGE)  有一种只用于PGD的技术是变性梯度凝胶电泳(DGGE)，与SSCP一样，是以不同碱基对特异性序列具有不同物理特性为原理的筛选方法。突变序列在聚丙酰胺凝胶电泳中当变性剂浓度增加使具有不同的融化特性，从而影响迁移率。在行DGGE之前的PCR引物中通常增加4O个左右的鸟嘌呤或胞嘧啶残基。这一序列能明显增加DNA片段中变异序列的检出率(检出率为95％)。然而，有时鸟嘌呤或胞嘧啶残基会降低PCR效率，在单细胞水平，可能会使PCR失败。以鸟嘌呤或胞嘧啶残基作为内侧引物进行巢式PCR可以解决这一问题。DGGE植入前遗传学诊断中用于各种类型的s一球蛋白突变的诊断。

7．基因芯片(DNA chip，gerle chip)  这是以DNA碱基配对、序列互补原理为基础分辨单个核苷酸，实现DNA序列的分析。具体步骤包括：①DNA阵列的集成：即将大量DNA特殊片断作为探针，固化在载体上，形成密集、有序的分子排列；②样品的制备和分子杂交：纯化DNA或RNA待测样品，与基因芯片进行分子杂交；③杂交信号的检测和分析：通过荧光扫描检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量，使样品中的基因成分被鉴定。由于基因芯片具有巨大的分析能力，样品的用量极少，使用简便，还因具有可在同一杂交板上同一杂交反应中进行不同样品的比较等优点，具有高度的敏感性和特异性，可以获得丰富的信息，故对一些基因突变和基因拷贝数改变的遗传性疾病的诊断，该方法显得非常重要。

总之，随着对单细胞分析所遇困难的深入理解，单细胞诊断技术在不断提高。无论单细胞诊断会面临什么样的困难，相信随着分子生物学技术的发展和人类基因组计划的完成，将有更多、更先进的方法应用于更多种遗传性疾病的植入前遗传学诊断。