动植物样品的采集及DNA样品的提取

动物样品的采集及处理方法

遗传学数据在野生动物和圈养动物的保护和管理中变得日益重要。在本文中，我们总结了一些能简便而有效地获得样品及数据的方法。

我们在采集样品之前，最好对将要进行的遗传学分析有所了解。然而，采集者并非都是研究者，当采集地与实验室有相当距离时，采集者常常要保存好样品直到有合适的接受者或存放地，这就要求采集者应具备一定的经验。

首先，所有样品均应以个体序号进行标注，并且应写上种名、性别、采样者姓名以及采集日期，越详尽越好，以便同一个体的不同类数据可以相互引用，另外，地理来源的标注也很重要，需要注明。

对于野外捕获的动物，有条件者最好在地图上标明捕获地及其经纬度。对圈养动物的每个野外捕获种源都要有同样的记录和详尽的谱系图，因为谱系图可用于计算近交系数。

总之，背景资料越详细越好，即使不能得到这里所列的全部信息，也要尽可能详尽。

1 样品的测量方法

在一定数量的分类群中采用的标准测量方法可用于以下四个方面：

（1）分类学上：一套理想的测量方法应能大致上重建机体每个主要硬件部分的形状和大小。

（2）不对称性分析：机体各部分的起伏不对称，也许表明进化过程在一定程度上正在变得不稳定，这可能是环境压力或近交的结果。测量不对称时机体左右两部分均应考虑在内。

（3）遗传变异：在科级水平上，如果对同一年龄的个体采用同样的测量方法，就有可能对所选特征中的遗传成分变异进行粗略的估计。虽然并非总是能做到这样，但能使遗传学家对所选特征（如生殖特征方面遗传变异的任何丢失）进行监视。

（4）生理检测或记录：采用标准测量方法得到的记录，也许会有助于与用其他手段得到的数据联系起来分析。例如，如果有了精子形态的记录，或是特殊寄生物的感染记录，遗传学家就能因此寻找在不同群体中这些因素与变异水平的相关性。

2 组织样品的采集和保存

下面详细给出针对不同研究目的的适当方法。当然，每个实验室都有各自习惯的组织处理方法，因此，本文仅给出快速保存的有关要求，但对每种组织的可用性都有所评述，以便在用途有冲突时，能对潜在数据的可能应用作出迅速判断。

使用肿瘤、毛发及精子样品，保存时应特别注意。使用细胞培养样品可减少对活体或新杀动物的依赖，如果培养物来源于肿瘤组织细胞，则可大量减少对同种动物组织的进一步需求。组织材料必须在数小时内送到有关实验室或用于其他的细胞培养。

如果已经知道DNA 序列的一小部分，就可利用PCR 技术从很少一部分组织中扩增DNA，从而使极其稀少的样品（如一根毛发或单个精子）具有更高的利用价值和更大的可信度。

组织必须取自活体动物或死后1～2 分钟内的动物，并且要快速保存起来，除非出现下述情况：在野外条件或是匆忙安排的活体取样，因此没有时间同实验室联系。此时要有目的地扩大采集和储存量。如果已经详细知道样品的确切用途，则有时条件可以放宽。

例如，对血液样品来说，有些酶是不要求立即冻存的。快速冻存时样品可放人液氮、干冰中或直接放入－70℃冰箱。冻存样品可在―70℃液氮、冰箱、干冰或－20℃冰箱中保存和运输。样品冻存及运输均以放入液氮中效果较好。非冻结冰箱是不能用的。

3 用于染色体研究的软组织的处理

室温下将全部或部分样品浸入0．9％的生理盐水中，在数分钟内将样品送至实验室，最迟也要在1～2 小时之内送到。

研究染色体能看到有丝分裂和减数分裂，从而了解有关染色体倒位等现象。染色体倒位会影响到受精和遗传重组，可能的同性个体应从染色体方面进行检查，但对哺乳动物来说，通常不需要研究同性别的染色体。

4 用于成纤维细胞培养的组织的处理

通常来源于幼体动物的组织用于细胞培养较好。在一个个体中，癌组织和肺组织是最好的，但其他软组织也可以用。

细胞培养常用的是新鲜组织，但捕杀几天后的动物组织仍能用来培养。总之，样品越快到实验室，成功的可能性就越大。

如果取样时需切开活体动物的皮肤，则应当在无菌的条件下进行。对细胞培养来说，无

菌条件下进行进一步的处理也是很有必要的，而在野外这是难以做到的。因此，一个不透风的封闭空间以及面具、手套是很有用的，至少操作人员应离开工作台面远一些。所有的台面、试剂瓶、手套、仪器等使用前要用70％的酒精消毒。所用的试剂应是新鲜的，如果对其无菌性有任何怀疑（如变浑浊或变颜色）就应倒掉。

在无菌条件下将组织样品放入0％的酒精中，摇动1 分钟后，将样品转人收集液中，在室温下放置1～4 天。如需放置更长时间，则两天后须将组织样品转到运输液中，就可再于室温下存放几天。转移过程中无菌操作是很重要的，因为运输液中一般不使用防腐剂。

收集液和运输液一般由接受样品的实验室提供。成纤维细胞培养可生产出更多的材料而不必再从动物中取，达到事半功倍的效果。

7.1.2.3 用于染色体研究的血样的采集

采血样须无菌操作。采血用的注射器、小瓶等应用肝素润湿。有些用品买来时就已经用肝素处理过。迅速将血样送往实验室（在低温条件下但不使其冻结）。如果条件不允许，可在无菌条件下，每 0．lml 血样加 5ml 的血样处理液，然后在室温下转送到实验室（实验室会有另一种准备好的处理液）。

7.1.2.4 用于酶及其他蛋白质研究的软组织的处理

将软组织切成1cm 见方的小块，包好并迅速冻存。如将组织块浸泡在2％的苯甲醛中，在室温下放置，某些酶的活性可保持几个月（Nakanishi 等1969）。一些鱼类蛋白质可以用市场买来的材料进行分析，但这里的目的是区分种，而不是为了获得详尽的遗传数据。

7.1.2.5 用于酶和蛋白质研究的血样的采集

试验所用的注射器、试管等应用肝素包被（最好是锂盐），或者是用低温保存的肝素润湿。如果可能的话，所有溶液配制等操作均应在5℃条件下快速完成。对于较大体积的样品（＞5ml），最好将红细胞、白细胞、血浆分开。首先在1000r／min 离心10 分钟，快速吸取血浆，迅速分装冻存。然后吸出漂浮在红细胞表面的一层白细胞带，再用5～10 倍体积的PBS 将红细胞洗两次后离心，最后将片状沉淀物快速冻存。

白细胞层用ACK 溶解（0．15mol／dm^３ 氯化铵、0．01mol／dm^３ 碳酸氢钾、0．lmol／dm^３ Na_２ EDTA），直到变成澄清的红色（约 5 分钟）。在 500r／min 离心 5 分钟后，小心吸去 ACK 和红细胞碎片，剩下的白细胞会重新悬浮于 ACK 中。2 分钟后，细胞成团沉淀，此时再用 PBS 洗。如果沉淀物仍为红色，则将整个过程重复一次，而后将其冻存。白细胞（酶的最好来源）也可以通过将等

7.2 动物组织DNA 样品的提取

目前提取高分子量的DNA 的方法已有很多，我们在这一部分中除了介绍常规的DNA提取方法外，还将着重讨论由微量样品(如毛发)和陈旧古老样品提取DNA 的一些新方法。

7.2.1 提取动物总DNA 的常规方法

从动物组织中提取DNA 的常规步骤如下：

(1)取动物组织100mg 左右于样品管中，用干净的剪刀将组织块剪碎。

(2)在样品管中加入如下试剂：

500μl STE 溶液

25 μl 蛋白酶 K(Proteinase K，10 mg／ml)

75μl 10％ SDS

3)混匀后置56℃下消化2 小时以上(隔一定时间混匀一次)。

(4)加人等体积的饱和酚溶液，轻轻颠倒混合5 分钟以上(用于rDNA 和RAPD 分析的样品需抽提24 小时)。

(5)7 000r／min 离心5 分钟。

(6)小心将上层清液移至另一干净的离心管中，加入等体积的苯酚及氯仿，并重复步骤(4)和(5)的抽提过程。

(7)以等体积的氯仿(内含1／25 体积的异戊醇)重复步骤(4)和(5)的抽提过程。

(8)在上清液中加入1／10 体积的 3mol／dm^３NaAc 或 5mol／dm^３NH_４Ac、2 倍体积的冷无水乙醇或1 倍体积的异丙醇，以沉淀DNA。

(9)置-70℃下沉淀2 小时或置-20℃下沉淀过夜。

(10)7 000r／min 离心10 分钟，再以 70％冷乙醇洗涤DNA 沉淀一次。将沉淀置真空干燥器或37℃温箱中干燥。

(11)以适量的TE 溶液(200～500μl)溶解DNA 样品。

(12)以分光光度计测定DNA 的浓度(260nm)，260／280nm 的光密度比值应在1.8 以上，否则提示可能有蛋白质或苯酚的污染。

(13)以TE 溶液将DNA 样品稀释成所需的工作液的浓度。

(14)取2μl 左右的样品进行电泳检测，以判断DNA 是否有降解以及是否需要消除RNA。

7.2.2 微量动物组织样品的总DNA 提取方法

从微量组织中提取DNA 的方法是1989 年由Singer-Sam(Walsh 等1991)发展起来的。此方法的基本原理是采用BioRad Chelex 100(一种螯合剂)提取DNA。此方法简便、快速，提取后的DNA 样品可以直接作为PCR 的模板。具体的操作步骤如下：

(1)取一小块冰冻的组织(少于1mg，可用经消毒的枪头钻取)，或1～3 根带有毛根的毛发(需先经90％、70％的乙醇和灭菌水依次清洗，并剪去毛干部分)，或 1～5μl 血液，加入经过高温消毒的离心管中。离心管内事先加入 500μl 5％的Chelex 溶液。

(2)将样品管在56℃下放置1小时或更长时间，直至组织样品成粉末状(不同组织所需时间各不相同)。

(3)在振荡器上振荡10～15 秒钟。

(4)在95～100℃下煮15～40 分钟。

(5)在振荡器上振荡10～15 秒钟。

(6)将样品管在4℃下保存，进行PCR 反应之前再次离心，使Chelex 颗粒沉淀。取上清液(1～10μl)作为DNA 模板。

7.2.3 陈旧、古老DNA 样品的提取方法

对于陈旧、古老DNA 的研究始于80 年代中期。1985 年，Paabo 采用克隆的手段首次从古埃及木乃伊中提取并测定了一段DNA 序列。然而，较为广泛地开展对古老DNA 的研究是在多聚酶链式聚合反应(PCR)发明以后才开始的(Mullis，Fallona 1987)。

经过一定时期的物理、化学作用(几十年至几百万年)的DNA 往往存在比较严重的降解，DNA 片段常常仅有几百个bp 的长度，并且可能存在碱基的修饰和一些抑制PCR 反应的物质。因此，在从陈旧或古老样品中提取DNA 时，最为关键的问题就是防止现代DNA 的污染。进行DNA 提取操作的所有器皿、器械和试剂均要进行灭菌处理，提取过程应在超净台中进行。此外，提取时应设阴性对照，以监测是否存在外源DNA 的污染。下面介绍的是一种较为简便的提取方法。

(1)取样品少许(如哺乳动物的皮张可取1cm × 1cm 见方的小块)，用剪刀、手术刀等器械对样品表面进行处理，除去最容易遭受外来污染的表层。对于骨骼、琥珀等坚硬的样品则需要用小钢钻等特殊器械从内部取得样品。

(2)经过表面处理的样品用90％乙醇、70％乙醇和去离子水依次进行清洗。

(3)在灭菌的 Eppendorf 管中加入200μl 去离子水、10μl 蛋白酶K(10mg／ml)和 1／10 体积的(20μl)10％的β-巯琉基乙醇。处理过的样品放入上述溶液前要尽可能剪碎。

(4)在56℃下消化48小时。

(5)样品管中加入等体积的5％～10％的Chelex100 溶液，在旋涡混合器上振荡5～10秒钟，然后在98℃下放置20～60 分钟。

(6)振荡混合5～10 秒钟，并使之冷却至室温。

(7)12000r／min 离心5～10 分钟。

(8)小心取出上层清液，置另一干净的管中保存。

7.3 植物总DNA 的提取

1976 年，Millgan 用Blin 和Stafford 描述的方法分离了植物DNA，然而这些DNA 是不能用于克隆的。在发明了去除植物DNA 上污染物的方法之后，人们可用分离动物组织DNA 的方法分离植物DNA。去除植物带电高分子污染物的方法有核分离(Bickle 等1977)。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)分离(Murray，Thompson 1980)和盐酸／十二烷基肌氨酸钠分离(Sung，Slightom 1981)等。在这些方法中，CTAB 方法因简便、快速而使用最广泛。收集和保存植物组织的方法对于 DNA 的产量和质量也有很大影响。虽然已能成功地从植

物标本和化石中分离出 DNA(Doyle，Dickson 1987)，但采用新鲜材料能产生最好的结果，特别是对于产生大量单宁、酚或其他次级代谢产物的种。如材料不能马上进行提取，应保存在冷而湿的地方，例如在冰盒中。如有必要可以冷冻保存。如果没有条件，最好在无水CaSO_４瓶中快速干燥(Liston 等 1990)。DNA 的提取应尽快进行，以防其降解(Pyle，Adams1989)。

提取DNA 的过程中有许多因素能导致DNA 降解。首先是物理因素。因为DNA 分子量较大，机械张力或高温很容易使DNA 分子发生断裂。因此，在实际操作过程中应尽可能轻缓，尽量避免过多的溶液转移及剧烈的振荡等，以减少机械张力对DNA 的损伤，同时也应避免过高的温度。其次，细胞内源DNA 酶及细胞破裂释放的次级产物也会导致DNA 降解。所以在提取DNA 的实验中，设计了许多可供选择的分离缓冲液，以适应不同的植物材料。分离缓冲液的pH 值有时需要进行改进，pH 应避免接近降解酶的最适点。大多数降解酶和脂肪氧合酶pH 值的最适点在 5.0～6.0 之间，而DNA 酶pH 值最适点在 7.0 左右(Dunham，Bryant 1963)。由于在过酸的条件下，DNA 脱嘌呤会导致DNA 的不稳定，极易在碱基脱落的地方发生断裂，所以大多植物DNA 提取缓冲液的pH 值为8.0，有的甚至为9.0。缓冲液中包含了大量的复合物，如 EDTA(乙二胺四乙酸)、SDS(十二烷基硫酸钠)、牛血清白蛋白(BSA)、β-巯基乙醇、谷胱甘肽、二硫苏糖醇(DTT)、抗坏血酸(Vc)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、二乙基焦碳酸盐(DEPC)、溴化乙锭(EB)等(Hallick等1977)。但由于上述物质有些是抑制内切酶和非特异性核酸酶的，所以在其后的步骤中要将其除去。分离DNA 与蛋白质一般采用苯酚－氯仿抽取的方法。苯酚、氯仿对蛋白质均有极强的变性作用，而对DNA 无影响。下面的方法描述DNA 与污染物多糖的分离，也可用阴离子交换层析仪来进行。下面列出了3 种常见的分离植物总DNA 的方法。3 种方法溶解细胞膜和分离蛋白质的方法不同，各有其优、缺点。

7.3.1 CTAB 缓冲液方法

这是最广泛地用来分离植物DNA 的方法，对大多数植物种都适用，特别是当样本数量很小时。此法运用阳离子去污剂CTAB 溶解植物细胞膜，并与DNA 形成一复合物。其优点是不需要准备大量的植物组织，而且适合像叶、根、种子、胚、胚乳、花粉和悬浮培养的组织等多种类型的组织(Rogers，Bendch 1985)。另外，此法对样品数量的要求也不高，从小到毫克数量的标本(木乃伊、化石)到许多克的新鲜材料均可使用(Golenberg 等1990；Rogers Bendch 1985)。

7.3.1.1 CTAB 的实验方法

1.材料

(1)2 倍CTAB 缓冲液：

100 mmol／dm^３Tris-HCI，pH 值 8.0

1.4mol／dm^３NaCI

20 mmol／dm^３EDTA

2％CTAB(W／V)

1％PVP-360(W／V)

0.2％ß-巯基乙醇(体积比，用前在通风橱中加)

(2)清洗缓冲液：

76％乙醇

10 mmol／dm^３乙酸铵

(3)悬浮缓冲液：

10 mmol／dm^３乙酸铵

0.25 mmol／dm^３EDTA，pH 值 8.0

2.步骤

(1)加热分离缓冲液、研钵、研杵到60℃。

(2)在热研钵中放人0.5～1.5g 新鲜或冰冻的叶子，用7.5ml 2 倍CTAB 分离缓冲液研磨(可加些石英砂帮助研磨)。对冻干的组织用1 倍CTAB 缓冲液研磨。把研碎的组织倒入50ml 管中，再用0.5ml 2 倍CTAB 缓冲液冲洗研钵，将冲洗液加到管中。

(3)将试管在60℃下放置30～60 分钟，然后轻轻振荡，使之充分混合后降至室温。

(4)在试管中加入10ml 氯仿－异戊醇(24:1)萃取液(如颜色深可再进行一次)，轻轻摇晃使其混合，在室温下1500r／min 离心5 分钟，使其分相。

(5)将上层的水相倒入－15ml 管中，加2／3 体积的冷异丙醇，轻轻混合以沉淀核酸。如果看不到核酸沉淀，可在-20℃下放置20 分钟或更长时间。

(6)室温下800r／min 离心3～5 分钟，如果看不到小团或沉淀，可在-20℃下放置 20分钟再离心。

(7)小心地倒掉上清液，不要倒掉核酸，这时的核酸一般松散地贴在管的底部，加15ml清洗缓冲液，轻轻地旋转清洗沉淀物，15～20 分钟后核酸将变得更白。

(8)室温下800r／min 离心5 分钟(如不充分，则加大离心速度或延长离心时间)，倒掉清洗缓冲液，将管倒扣在纸巾上，让沉淀物干燥，小心不要让DNA 滑掉。

(9)按沉淀物的大小用少量悬浮缓冲液(10～100 μl)悬浮DNA。

(l0)用100μg／ml RNAase 在 37℃下温育30～60 分钟。

(11)如果组织包含单宁或其他次级产物，可以对 DNA 作进一步纯化(可用氯仿、苯酚纯化)。一些材料可能需要用氯铯(CsCl)梯度纯化。上述方法也可以进行改进，像巯基乙醇的浓度可以提高至 25mmol／dm^３，也可加入 l％的抗坏血酸、DTT 等，CTAB 也可用 SDS 取代(Golenberg 等1990)，也可用 TE(10mmol／dm^３Tris-HCI，pH 值 8.0，lmmol／dm^３EDTA)作悬浮缓冲液。

7.3.1.2 CTAB 沉淀法

1.材料

2 倍CTAB 分离缓冲液；沉淀缓冲液：

100 mmol／dm^３Tris-HCI，pH 值 8.0；20 mmol／dm^３EDTA；2％CTAB(w／V)。

2.步骤

(1)与7.3.1.1 中前4 个步骤同。

(2)吸取上层水相，将其例入一个15ml 管中。

(3)加3 倍体积的沉淀缓冲液，使NaCI 的浓度减少到 0.35mol／dm^３，室温下放置 30分钟。

(4)室温下2 000r／min 离心5 分钟，以沉淀DNA。

(5)根据沉淀物的大小，用少量的悬浮缓冲液(10～100μl)悬浮DNA。

(6)虽然氯仿或苯酚提取DNA 是有效的，但是对那些包含单宁或其他次级产物的组织，可以在氯化铯梯度上进一步纯化。

7.3.2 蛋白质沉淀方法

这个方法可以产生高质量的DNA，但产量也是最低的。一般在沉淀核酸之前用乙酸钾沉

淀蛋白质和多糖(Dellaporta 等1983；Galau 等1988；Hughes，Galau 1988)。此方法不需要有机提取，而且快速，所以对大量样品比较合适。

1.材料

提取缓冲液：100mmol／dm^３ Tris-HCI，pH 值8.0；50mmol／dm^３EDTA，pH 值8.0；500mmol／dm^３NaCl；2％SDS(w／v)；l％PVP-360(w／v)；0.1％β-巯基乙醇(体积比)，用之前在通风橱中加。

2.步骤

(1)用液氮在研钵中研磨1.0g 新鲜叶子，可以加一些石英砂帮助研磨。将研磨完毕的粉末贮存在-80℃冰箱中，在加提取液之前，不要让植物材料融化。

(2)在冰冻的组织中加6ml 提取缓冲液，转到一个15ml 的离心管中，充分振荡大约30 秒钟，使之混合均匀，然后在65℃下放置20 分钟。

(3)往管中加入2ml 5mol／dm^３乙酸钾(pH 值6.5)，充分摇匀，在冰水中放置5 分钟。随着不溶的十二烷基硫酸钾的沉淀，大部分蛋白质和多糖作为复合物被除去了。

(4)在4℃下2 000r／min 离心20 分钟。

(5)吸出上清液，将其倒入一个干净的15ml 的离心管中，不要带入颗粒物质，然后加4ml 异丙醇轻轻混合，在-20℃下放置。

(6)在4℃下2 000r／min 离心15 秒钟，DNA 沉淀后，轻轻地倒掉上清液，在纸巾上倒扣10 分钟或更长时间，以干燥沉淀物。

(7)将沉淀物放在100TE 中溶解，然后将溶液倒入一个1.sml 离心管中，离心5分钟，移去不溶的沉淀。

(8)将管中上清液倒入另一个1.5ml 离心管中，加75μl 3mol／dm^３NaAc(pH 值7.6)和500μl 冷异丙醇，充分混合，在-20℃下放置1～2 小时，拿出后再在室温下放10 秒钟，使管中DNA 沉淀。

(9)用500μl 80％乙醇洗沉淀物10分钟，离心1分钟，干燥沉淀物10分钟。

(10)根据DNA 沉淀物的大小，用少量的TE(10～100μl)溶解DNA。

7.3.3 氯化铯方法

这个方法的原理是根据在氯化铯(CsCl)中的不同密度梯度来分离细胞成分。此方法可以产生大量高纯度的DNA，但费时，而且需昂贵的仪器设备，对需要复杂的有机提取或沉淀的材料比较适合(Carr，Griffith 1987；Weeks 等 1986)。在一些情况下，它可能是在含大量次级产物的植物中提取高质量DNA 的唯一方法。DNA 可以在一个平衡的CsCl 梯度中通过与以下几个染料中的一个结合而被纯化， 这几个染料为溴化乙锭( Ethidium bromide)、Bisbenzimicle、碘化丙锭(propidium iodide)、Bisbenzimide，它们不同的浮力密度对分离不同的染色体组特别有用。

7.3.4 PCR 小量制备法

此方法的优点是一次可以提纯很多样品，比较快速，而且小于10mg(50mm)的新鲜叶子材料就可以产生足够的DNA，产生的DNA 对杂交实验是可用的(Millgan 1992)。这个方法存在的问题是DNA 沉淀物可能不够紧密，或不一定能形成一紧密的DNA 沉淀。

1. 材料

分离缓冲液：200 mmol／dm^３Tris-HCI，pH 值 8.0；250 mmol／dm^３NaCI；25 mmol／dm^３EDTA；0.5 ％ SDS。

2.步骤

(1)用1.5ml 离心管研磨小的组织样品。可取管口大小的新鲜叶子(＜10mg)，冻在液氮中的叶子也可用。

(2)在研碎的样品中加400μl 的分离缓冲液，用适合的速度涡旋10秒钟，以分散开样品。

(3)在室温下将1.5ml 离心管中样品离心12～15分钟，沉淀细胞内物质。

(4)搜集300μl 的上清液，弃去沉淀。

(5)在上清液中加300μl 预冷异丙醇，倒转样品1～3 次，使之充分混合，在室温下至少放置5分钟。

(6)将微离心管中的样品在室温下离心20分钟，以搜集沉淀的DNA。

(7)弃去上清液，用300μl 80％的乙醇室温下沉淀10分钟。

(8)室温下离心样品12分钟，弃去上清液。

(9)用300μl 80％的乙醇再洗后，室温下离心5分钟，弃去上清液。

(10)室温下干燥样品1小时或将样品放过夜。

(11)用100μlTE悬浮样品。