细胞培养常用设备及实验技巧（二）

细胞的复苏

细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

具体操作

一、实验前准备：

1.将水浴锅预热至37℃。

2.用75%酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。

3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。

二、取出冻存管：

1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。

2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

三、迅速解冻：

1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。

2.约1～2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

四、平衡离心：

用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min离心3min。

五、制备细胞悬液：

1.吸弃上清液。

2.向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。

六、细胞计数：

细胞浓度以5×105/ml为宜。

七、培养细胞

将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃和5%CO2的培养箱内2～4小时（或者24～48小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。

初学者易犯错误：

1.水浴锅未预热或者未预热到37℃。

2.水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。

3.离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。

4.一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。

细胞计数

实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。

具体操作：

一、准备工作：

取一瓶传代的细胞，按照《传代细胞培养（消化法）》中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以被使用。

二、细胞悬液制备：

细胞悬液的制备方法是用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。