PCR扩增反应在食品转基因成分鉴定中的应用

转基因生物(GMO)的检测在农业与食品工业中的用途十分广泛 。学术界对转基因生物的观点各不相同，一方面可以利用转基因技术来产生抗病、抗虫害型作物来增加农业产量，而另一方面，转基因生物与野生群落的共同分布可能会威胁到物种的多样性。

从长远看来，转基因生物对整个环境和人类的影响还是未知的。这也就是一些国家的议员们始终对转基因作物实行严格地控制，并使其不能普及的原因。

在欧洲，必须明确标示食物中的转基因成分。而对于那些标有不含转基因成分的食物来说，生产商必须确定其所用的原材料一定是不含转基因成分的，为此政府已建立了检测食品中转基因成分的体制。其中，最重要的是转基因检测方法的可靠性和有效性。

所以我们利用分子生物学技术建立起一套基于PCR反应的实验方案，用于食品质控实验室的工作。最要害的是第一步：DNA提取，我们做了很严格的监控 。

我们依据植物基因组和质粒DNA的提取效率来选择DNA提取试剂盒。整个提取过程包括破坏细胞壁、去除RNA和利用沉淀去除蛋白质，然后将DNA吸附在层析柱上，经过洗涤后再洗脱下来。类似的方法已经用于从其他一些植物和病毒中提取DNA。

PCR反应的过程分为三个阶段：

(1)通过加热使双链DNA变性。 (2) 降低温度使得引物与模板序列结合。(3)DNA链沿着引物方向延伸。

三个步骤称为一个循环，PCR是由若干个重复循环组成的。DNA的数量呈指数扩增，这就意味着每经历一个循环，DNA量增长一倍。理论上，30个循环后DNA被扩增了109倍，从而可以清楚地在电泳凝胶上显示出来。

实验中的PCR引物是针对两种类型的基因设计的：

第一，对引物是用来扩增内源性植物基因，如叶绿体基因和特异性的大豆lectin基因，以证实植物DNA尤其是大豆DNA的存在。

第二，对引物是扩增通过基因转化而引入的外源序列，这些序列通常不存在于野生型植物中。其中，这两个外源的DNA序列与花椰菜花叶病毒的35S启动子和根癌农杆菌的NOS终止子整合在一起。

假如这两个序列的任一个被扩增出来，则表明外源基因已经转化入植物基因组中。原则上所有已批准的转基因农作物都是用含有这两个元件或其中任一个的构建载体转化的。对于一些在转基因构建载体中新使用的启动子和终止子序列的检测，逐渐成为科学家们关注的焦点。

目前，已经设计了一些针对不同大小产物的引物对。表1为合成的引物序列，选择退火位点生成单一DNA片段，以便于结果的分析。PCR反应后，这些片段可以在琼脂糖凝胶电泳上以条带的形式显现出来。

一、实验过程

1.材料：

大豆粉(转基因的和非转基因的)：分别购于Soy Bean Powder SB-Set 和 Fluka ；

植物DNA 提取试剂盒(DNeasy Plant Kit )；

Taq PCR core kit(QIAGEN)；

琼脂糖凝胶电泳系统(Amersham Biosciences, Inc.)。

2.方法：

(1)植物DNA 的提取与纯化：

利用 DNeasy Plant Kit ,依照下列步骤进行DNA的提取与纯化。

(a)预热AE buffer 到65℃ ；

(b)称取大豆粉0.1g ,放入2ml Eppendorf 管；

(c)加入400μl AP1 buffer 和4μl RNase (100mg/ml )，混匀，注重避免皮肤接触AP1 buffer ，65℃孵育10-15min ；

(d)加入130μl AP2buffer ,混匀，置于冰上5min ,(在酸性溶液中蛋白质和多聚糖可发生沉淀)，冰浴，沉淀未折叠的蛋白质，或使其他蛋白质发生错误折叠，并灭活DNA 酶。溶液AP2含乙酸，应避免皮肤接触；

(e)12000×g将混合液在 QIA shredder 离心柱上离心2min (以除去细胞壁和沉淀)；

(f)将溶液转移至另一干净的2ml Eppendorf 管中，弃去沉淀；

(g)加入0.5倍体积的 AP 3溶液，混匀。为了避免氯化物的生成，不要将 AP 3溶液与次氯酸钠混合。加入1倍体积的无水酒精，混匀；

(h)将溶液放在 DNeasy minispin 柱上，10000×g离心1min (使DNA 附着在层析柱上)。柱子的最大容积为650μl ,此步骤可重复若干次；

(i)将柱子放置于新的2ml Eppendorf 管中,吸取500μl AW buffer 放入柱子中心，10000×g 离心1min (洗涤DNA ,除去盐分)；

(j)重复一次,吸取500μl AW buffer 放入柱子中心，10000×g离心2min (确保除去所有的缓冲液)，在使用前2min 从温育中取出 AE buffer ；

(k)将柱子放置于一新的2ml Eppendorf 管中，吸取100μl AE buffer 放入柱子中心，10000×g离心1min (洗脱DNA )；

(l)重复(K)步骤一次；

(m)将装有DNA 溶液的Eppendorf 管置于冰上。

(2)PCR扩增反应

(a)使用QIAGEN 的PCR Core Kit ,用四种不同的引物对来扩增纯化的DNA 。管A 含叶绿体DNA 特异性引物，管B 含LeCtin特异性引物，管C含NOS终止子特异性引物，管D含35S启动子特异性引物。每一管依次加入下列溶液：

33.9μl 的MilliQ水(总体积达50μl )，5μl10×PCR 缓冲液(100mM Tris-HCl buffer ，pH 8；500mM KCl ；15mM MgCl₂)，5μl 预先预备好的DNA 溶液，混匀，置于冰上。每管中再加入5μl 的相应引物(起始浓度0.1μg/μl )，稍微混匀，置于冰上。然后再加0.6μldNTP(起始浓度10mM)和0.5μl(1U)的Taq 酶(QIAGEN Taq Polymerase Core Kit , QIAGEN)。稍微混匀，再置于冰上。
 

(b)PCR反应条件：

第一步：94℃，10min ；

第二步：94℃，1min ；63℃，1min ；72℃，1min ，34个循环；

第三步：72℃，10min ；4℃保存。

(3)凝胶电泳

在PCR反应进行中，用0.5×TBE 制备3%w/v 的琼脂糖凝胶。PCR 完成后，分别用四个Eppendorf 管将8μl 的扩增产物与1μl 6×加样缓冲液(含10 % 甘油的0.3M EDTA , 0.25% 溴酚蓝，0.25% 二甲苯胺和0.25% Orange G )混合。在第五个管中将3μl100 bp DNA ladder 和0.5μl 6×加样缓冲液混合。分别依次将样品加入凝胶的加样孔内，在200伏电压下进行电泳，直到 Orange G 跑到胶的最下端(大约需30min)。电泳终止后，用溴化乙锭染色，在紫外灯照射下观察条带，并拍照记录(图1)。

二、结果分析

图1中的M列为100bpDNA marker , 包含了100-1500 bp 的片段。1-8列为PCR扩增的结果。1和7为叶绿体基因的扩增结果，2和8是Lectin基因的扩增结果，3和5为35S的扩增产物，4和6为NOS 扩增产物。

从图中可以看出两种可能的结果，前四列为非转基因大豆的DNA扩增结果，而后四列为转基因大豆的扩增结果。在1和7中，500 bp 的清楚条带代表叶绿体基因的扩增片段，这表明提取物中有植物DNA 。2和8中的118 bp 条带代表大豆凝集素的基因，这可以证实大豆DNA的存在。在另两组中，假如我们分别在727bp (NOS 扩增产物)和199bp (35S的扩增产物)处看到产物片段，就可确定所分析的大豆粉中含有转基因成分。同时，即使只扩增出这两个产物中的其中一个，仍可认为该样本含转基因成分。

图2显示的实验结果，我们可以看到在转基因大豆中可扩增出所有4个序列，而非转基因大豆中只扩增出叶绿体基因和Lectin基因序列。