放射免疫分析中影响标准曲线建立的因素

放射免疫分析(RIA)是由美国生物学家Yalow和Berson于1959年创建的一种体外放射分析技术，该技术有其结果可靠。简便易行，成本低廉，高灵敏度，高特异性的优点。其超微量测定可达ng至pg水平，目前可测物质已达300余种，对临床的诊断和治疗起着积极而重要的作用。

在实际工作实践中，标准曲线的制做非常重要。它可对整批实验结果产生重大影响。在放免分析测定中被测物质浓度是根据标准曲线计算得来的。

标准曲线的精确度直接影响测定结果的精确度。而根据少数的几个离散点建立起来的标准曲线如何尽量精确地反应B/B0％与样品抗原浓度之间的真实函数关系，却要尽可能地从实验中把关，因此制定标准曲线的每一步骤都要严格和精确。现就放免分析中有关标准曲线制做的影响因素进行一番分析。供同仁们参考。

一、试剂组份

（一）标准品标

准品的活性、免疫反应性以及纯度往往影响放射免疫分析的正确性，从而极大地影响结果。

要求标准品活性与免疫反应性和被测物质相一致，须是同源系统的。且稳定性好，易保存，不含交叉反应物质和干扰免疫反应的物质，定量应准确并与国际标准品一致。所谓标准品纯度不是指化学纯，它可以含杂质，但不应含有对放射免疫分析有干扰的物质。

（二）蛋白质

标准品与专一性抗体在平衡反应过程中，蛋白质有抑制作用，如被测物质应用血浆或血清，应在标准品内加入相同量的蛋白质，这样蛋白质对被测物质及标准品的干扰反应相一致。

（三）PH值和离子强度

抗原抗体反应在酸性或碱性环境中解离，因此该反应宜在接近中性或微碱性的环境中进行。其PH值以7.4-7.8为宜，离子强度0.05-0.1mol/L。既要有缓冲能力（离子强度不能太小），但离子强度过大又会阻止抗原抗体反应。

（四）反应容积、温度及时问

缩小反应容积可减少抗体和标记抗原的绝对用量，使非标记抗原的竞争力相应加强，能提高灵敏度，且反映试剂消耗减少。另一方面，由于小容积形成复合物的绝对量相应减少，放射性测量误差增大，而且由于加样容积变小，也易引起操作误差，一般宜先0.3-1.2ml的反应容积。

抗原抗体反应达到动态平衡需要一定时间，同时受温度的影响，反应温度每升高l0℃（不超过37℃）抗原抗体结合达到平衡的速度提高一倍，但温度升高会使抗原抗体反应的亲和力下降；而温度过高（60℃）时，则会使抗原抗体失活。

通常情况下，所测样品含量高，抗血清亲和常数大，可选择较高的温度（37℃）进行较短时间的温育。

但复合物结合牢度较差；若被测物含量低，抗血清亲和常数K较小时，应在4℃下较长时间温育，复合物结合牢度较大。不易解离。因此，放免室宜备空调环境，低温离心机温度应控制在15℃，以保证反应生成的沉淀物不易解离。

（五）肽酶、补体

某些物质如TRI-I，胰高血糖素等生物制品可受肽酶影响产生降解，所以在测定缓冲液中应加入一定量的抑肽酶，以抑制肽类激素的分解，此外，蛋白质激素及肽类激素作标准时，补体能影响抗原一抗体反应。

（六）抗血清

抗血清品质优劣直接影响标准曲线的建立。其主要质量指标应具有高效价、高亲和力和高特异性，非特异性的交叉反应率要小。使用抗血清稀释度要合适，稀释度过大，会使剂量反应曲线发生明显右移，在RIA分析中要兼顾尽可能大的抗体稀释度，又要具有很高的测定灵敏度。

（七）其它

试剂盒必须在有效期内使用，不同批号的试剂不得混用。试剂盒从冰箱取出后，应平衡至室温后使用。加样前必须彻底颠倒混匀所有试剂，特别是分离剂。所有冻干品复溶10-15min后方可使用。

二、加样过程

（一）人员

操作人员上岗前要经过基础理论和基本操作技术培训，包括通过加样一致性考核，加样误差要<2％，要严格按各药盒的说明书进行操作，防止由于工作人员情绪波动、草率和不遵守操作规程所造成的误差，由于操作精度随检查管数增加而下降，每人每天操作以不超过500管为宜。

（二）试管

质要地均匀，表面光洁度好，非特异性吸收低，不能沾有放射性核素，使测定放射性的自吸收和几何位置容易一致。

（三）加样

加样时量要尽量精准（特别是在加标记抗原时）加样器经长时间使用后弹簧的弹性及密封性会降低，影响其准确性，要经常校准加样器。为减少误差，加标准品与加样品时要使用同一加样器，要避免加标记抗原和抗血清时通过管壁及吸管尖的粘附而相互污染。同时应使用一次性吸量用具。不能随意颠倒标本、碘标记物和抗体的加入顺序。加样倾斜角度应一致，并根据需要选择正向或反向加样。

（四）每批试验必须同时建立标准曲线，不主张调用标准曲线，若调用以前所做标准曲线将造成整批测定结果的偏高或降低。特殊情况确需调用标准曲线，可用药盒附带质控品及患者正常样品标本进行严格质控方可，此外各浓度标准品应设2—3支复管，标本也最好设复管（切不可嫌麻烦），这是减少误差的重要保证。

三、测量仪器

要使用效率高、本底低，稳定性好的放射性测量仪器，并要采用足够的测量时间。放免计数仪应经常维护和保养。测量时试管上部的内外壁应干燥，以防探头污染。探测器最佳工作条件的选择可以制定出较好的标准曲线，从而获得可靠的测量结果，选择工作条件的方法通常有坪曲线测定或品质因素测定。

（一）坪曲线测定

探测器的光电倍增管必须在一定的高压状态下才能工作，这种高压应选择在电压发生少许波动时，对计数率影响较少的高压值，该高压值的选择是通过坪曲线来确定的，从多次测量的结果中，选出坪段较长且斜率较小的曲线，取该曲线坪段前1/3处所对应的高压值为工作电压 。

（二）品质因素测定

样品作相对计数测量时希望得到高的样品计数率和低的本底计数率，而样品计数率和本底计数率的关系是：品质因素(F)=E2/nb(E为测定效率，IIb为本底计数率)F越高，在该测量条件下，能获得较高的样品计数率和较低的本底计数率。应用坪曲线测定与品质因素测定，后者考虑因素较多，结果更为可靠。

四、曲线拟合模式

同一剂量反应曲线可以用不同的模式进行拟合，稍加比较可见其拟合程度好坏不一，并不是拟合程度越复杂越好。相关系数R2可做评价拟合精度的指标，R2越趋于1，拟合精度就越高，要求R2>0．990。DEV％是拟合百分比偏差，由此可看出每一标准品点的偏离情况，一般要求DEV％<10％，曲线拟合优度的常用指标为R2和DEV％。

应特别强调的是：对曲线的拟合，只是对由标准品及其相应的反应参数所决定的曲线段进行数学处理，在标准品给定的区间范围内，拟合的函数关系应保证其单调性，曲线拟合不能外推。同时应注意，无论用什么方法进行拟合，都不可能将坏的结果变为好的结果。只有把好实验关，才能真正提高实验结果的精度。

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