一步法制备感受态细胞

一、操作步骤：

1. 涂平板：为取得最佳的感受态效率，必须先把甘油菌或其它形式保存的菌种涂LB平板，并培养过夜。

2. 接种：取一有新鲜培养的菌种的LB平板，后续操作均在超净台内进行。把镊子的顶端在70%酒精中蘸一下，并在酒精灯上略略烧一下，使镊子的顶端处于无菌状态。用镊子夹取一个无菌的塑料枪头或牙签，从平板上挑取一个单克隆，然后把蘸有菌种的塑料枪头或牙签放到装有3毫升LB的细菌培养试管内。上述操作也可以使用接种环等进行操作。

3. 培养：37℃约200rpm培养过夜，通常培养时间控制在16小时左右为宜。绝对不宜超过18小时。

4. 再接种培养：根据需要制备的感受态细菌的量，按照1:100的比例用新鲜培养的过夜菌接种培养。例如取500微升的新鲜过夜菌到50毫升的LB中继续37℃约200rpm培养。通常在大约培养2-2.5小时后OD600可以达到0.3-0.5。

5. 制备感受态细菌：在培养的细菌OD600达到0.3-0.5时，4℃2000g离心5分钟收集细菌。如果离心沉淀前的菌量为50毫升，按后续操作进行，如果是其它体积则按比例换算后进行后续操作。用5毫升预冷的LB重新悬浮起细菌沉淀，加入5毫升在冰浴或冰水浴上融解的感受态制备试剂，混匀，冰浴放置5分钟。然后再轻轻混匀，根据实验需要适当分装到1.5毫升或0.5毫升的离心管内后-70℃保存。

注：如果以后会只做单管的转化，可以分装成每管最少50微升或100微升，如果以后一次性做多个转化，可以每管分装500微升或更大体积。-70℃保存后，感受态的效率会随时间的推移逐渐下降，但通常在半年内使用转化效率下降不会太多。总的来说，新鲜制备的感受态要比冻存的感受态转化效率更高一些。

二、注意事项：

1. 需自行配制LB液体培养基和LB平板以用于细菌的培养和感受态效率的检测。

2. 尽管凡是处于对数期内的细菌都可以用于感受态细菌的制备，但如果细菌生长的OD600的值达到0.3-0.5左右时，制备出来的感受态效果最佳。

3. 在制备感受态细菌的过程中均使用不含抗生素的LB。在使用感受态菌的过程中热休克后的37℃培养时也必须使用无抗生素的LB，即便转入的质粒是有抗性的。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。