TNF-α生物学活性检测方法

互联网2012-08-21

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基本原理

TNF的生物学活性之一是能直接杀伤肿瘤细胞。TNF与相应受体结合后向细胞内移，被靶细胞溶酶体摄取导致溶酶体稳定性降低，各种酶外泄，引起细胞溶解。肿瘤细胞株对TNF-α的敏感性有很大的差异，用放线菌素D、丝裂酶素C、放线菌酮等处理肿瘤细胞，可明显增强TNF-α杀伤肿瘤细胞活性。

材料和试剂

1，完全培养基（1）10%FCS-DMEM培养液（V/V）。

2，完全培养基（2）3%FCS-DMEM培养液（V/V）0.5-1μg/ml放线菌素-D。

3，0.05%结晶紫溶液：

取50mg结晶紫，用20ml无水乙醇溶解后，加水定容至100ml，室温保存。

4，脱色液：

H2O 50mg

无水乙醇 50ml

乙酸 0.1ml

混匀即可。

5，TNF标准品：由中国药品生物制品检定所提供。

实验操作

1，此实验在无菌环境下进行，实验前超净工作台应用紫外灯照射30分钟以上。

2，用完全培养基（1）将生长状态良好的小鼠L929细胞调至1×105/ml的细胞悬液，100μg/孔加入96孔细胞培养板，5%CO2，37℃培养过夜。

3，标准品稀释：用完全培养基（2）将标准品进行10倍稀释至100IU/ml为起始浓度，再做4倍稀释上板。

4，待检样品稀释：用完全培养基（2）将待检样品进行10倍稀释至一定范围，再做4倍稀释准备上板。

5，弃96孔细胞培养板上清，将标准品及待检样品按100μl/孔加入96孔细胞培养板，同时设对照组和空白组，5%CO2，37℃培养16小时。

6，镜检后，弃上清，每孔加30μl 0.05%结晶紫染色3~5分钟，用流水小心冲去结晶紫，甩干培养孔中的残余水份，加入脱色液100μl/孔，用酶标仪测定570nm的光密度值。

结果计算

1，在座标纸上以OD570比色值（双孔比色值的平均值）对稀释倍数作图，以标准品的最纸、最高平均值作平等于X轴的直线，以各相应样品曲线与该直线的交点，在X轴读出半效量的稀释度。

2，计算公式：

TNF活性（IU/ml）=标准品效价×样品预稀释倍数/标准品预稀释倍数×标准品半效量稀释度/样品相当于标准品半效稀释度。