酶促反应与时间的关系——初速度时间范围测定

[原理]

酸性磷酸酯酶（Acid phosphatase E.C.3.1.3.2）广泛分布于动物和植物中，植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺中。它对生物体核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢，骨的生成与磷酸的利用，都起着重要的作用。

酸性磷酸酯酶是酶动力学研究的好材料。它能专一性水解磷酸单酯键。本实验选用绿豆芽作材料，从中提取酸性磷酸酯酶。以人工合成的对-硝基苯磷酸酯(NPP)作底物，水解产生对-硝基酚和磷酸。在碱性溶液中，对-硝基酚盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。

利用产物的这种特性，可以定量地测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。即测定单位时间内405nm处光吸收值的变化，来确定酸性磷酸酯酶的活性。
酸性磷酸酯酶一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。

要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间，酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。可以通过进程曲线的制作而求出酶的初速度时间范围。本实验进程曲线是在酶反应的最适条件下采用每隔一定时间测产物生成量的方法，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。

从进程曲线可知，在曲线起始一段时间内为直线，其斜率代表初速度。随反应时间延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。求出酶反应初速度的时间范围是酶动力学性质的一系列研究中的组成部分和必要前提。

[ 试剂和器材]

1、 试剂 ：

（1）酸性磷酸酯酶原酶液

取萌发好的绿豆芽，剪去根的头部，称取豆芽茎20g，用蒸馏水洗干净，用研钵研碎，加0.2mol/L乙酸盐缓冲液4mL，置冰箱6小时以上。

将上述绿豆芽浸液倒入纱布内压榨，榨出液3 000r/min离心15min，上清液置透析袋对蒸馏水充分透析，间隔换水10次，透析24h以上。将透析后酶液稀释至最终体积与豆芽茎克数相等，以3 000r/min离心30min，所得的上清液即为原酶液，置冰箱待用。

（2）酸性磷酸酯酶液

取原酶液，用0.05mol/L pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲线中第11号管吸光度A405在0.6—0.7之间。

（3）1.2 mmol/L对-硝基苯磷酸酯（NPP）

精确称取NPP 0.4454g，加缓冲液定容至1000 mL。

（4）0.3 mol/L NaOH。

2、器材：

（1）恒温水浴槽

（2）可见光分光光度计

（3） 试管 、刻度吸管

[方法和步骤]

取 试管 12支，按下表编号，0号为空白。各管加入1.0mL 1.2 mmol/L NPP；另外2支试管，各加入稀释好的酶液7 mL，在酶反应前底物与酶都放入35℃恒温 水浴 槽中预热2分钟。然后向1～11号管内各加入1.0 mL 预热的酶液。立即摇匀并开始计时。

按时间间隔为3、5、7、10、12、15、20、25、30、40、50分钟进行反应。待反应进行到上述各相应时间时，加入3.0 mL 0.3 mol/L NaOH终止反应。冷却后以0号管作空白，在 分光光度计 上测定各管A 405 值。

~undefined 0号管加入1.0mL NPP后保温25分钟，然后加入3 mL 0.3 mol/L NaOH，再加入1.0 mL酶液。

[数据处理]

以反应时间为横坐标，A405为纵座标绘制进程曲线，由进程曲线求出酸性磷酸 酯酶 反应初速度的时间范围。