酶促反应与时间的关系——初速度时间范围测定

酸性磷酸酯酶动力学性质分析

酶促反应与时间的关系——初速度时间范围测定

[原理]

酸性磷酸酯酶（Acid phosphatase E.C.3.1.3.2）广泛分布于动物和植物中，植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺中。它对生物体核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢，骨的生成与磷酸的利用，都起着重要的作用。

酸性磷酸酯酶是酶动力学研究的好材料。它能专一性水解磷酸单酯键。本实验选用绿豆芽作材料，从中提取酸性磷酸酯酶。以磷酸苯二钠为底物，来测定酸性磷酸酯酶的活性。

磷酸苯二钠经过酸性磷酸酯酶的作用，水解后生成酚和无机磷，其反应式如下： 当有足够浓度的底物磷酸苯二钠存在时，反应产物酚和无机磷酸盐的浓度随着酸性磷酸酯酶活性的增加而提高，可用酚 试剂 测定产物酚或用定磷法测定无机磷。

酸性磷酸酯酶一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。

要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间，酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。可以通过进程曲线的制作而求出酶的初速度时间范围。本实验进程曲线是在酶反应的最适条件下采用每隔一定时间测产物生成量的方法，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。

从进程曲线可知，在曲线起始一段时间内为直线，其斜率代表初速度。随反应时间延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。求出酶反应初速度的时间范围是酶动力学性质的一系列研究中的组成部分和必要前提。

[方法和步骤]

取试管12支，按下表编号，0号为空白管。各管加入5mmol/L磷酸苯二钠溶液0.5mL，在35℃恒温水浴中预热2min后，在 1～10号管内各加入0.5mL预热的酶液。酶液一加入立即摇匀并开始计时。按时间间隔为3、5、7、10、12、15、20、25、30、40、50min在35℃恒温下进行酶反应。

待反应进行到上述各相应时间时，加入1mol/L碳酸钠溶液2mL再加入0.5mL Folin-酚稀溶液。各管继续保温显色10min。空白管所加 试剂 相同，但酶液最后加入。冷却后以0号管作空白，在 分光光度计 上测定各管A 680 值。

[数据处理]

以反应时间为横坐标，A 680 为纵座标绘制进程曲线，由进程曲线求出酸性磷酸 酯酶 反应初速度的时间范围。

管号 试剂	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	undefined
5mmol/L磷酸苯二钠	各0.5mL
35℃预热2min
稀释酶液（35℃预热）	各0.5mL
35℃反应时间/min	3	5	7	10	12	15	20	25	30	40	50	25
1mol/L碳酸钠溶液	各2.0mL
Folin-酚稀溶液	各0.5mL
35℃保温显色10min
A 680