pEGFP-N1为载体表达的核蛋白如何确证表达于核内

maoliping70：pEGFP-N1为载体表达的核蛋白要确证表达于核内的方法为用PI染色，PI只与核酸结合，在488nm激发下发红光，而GFP发绿光，红光与绿光重叠发黄光。还有以下疑问：

1.作为对照的pEGFP-N1空载体转染细胞后表达的GFP蛋白为27KD，能自由通过核孔复合体，也就是说GFP在核内也有表达，那会与PI重叠发黄光影响测定吗？

2.有提出GFP在细胞固定时，会从细胞漏出，那细胞本身表达的浆蛋白若分子量小，也会漏出吗？还是因为有定位信号而不漏出？

3.细胞固定用的70%乙醇是直接用水配制吗？有战友用含血清的PBS 0.3ml先混悬细胞再加0.7ml乙醇，到底如何操作呢？

4.此问题困扰多日，恳请有经验高手提出高见。谢谢！

丁香园网友MmpRS认为：

我最近也在做GFP转染，和你讨论一下，我个人的理解是

1。GFP是肯定进核的，文献有报导过。那么对于“PI重叠发黄光影响测定”，就看你是想测定什么了，首先GFP的定量是不准确的，如果你仅仅研究亚细胞定位的话，应该没什么影响

2。这个问题我也遇到了，固定的时间和固定液的种类都对GFP的荧光强度有影响，我现在是用冰的无水乙醇固定20分钟，效果不好，下一步打算换4%低聚甲醛（参考文献），固定5min或10min，等有了结果在和你说，反正就是多换换吧。我认为细胞本身表达的蛋白，如果是游离的应该也会漏出，有些小蛋白没有出去，是因为和细胞骨架蛋白相互作用了，或者可能在特殊的细胞器中。

3。自己搜索一下固定液吧，参考免疫细胞化学的固定就OK了

丁香园网友maoliping70认为：

非常感谢MmpRS战友，这几天外出，没有上网，我这儿有老师是用-20度预冷的70%乙醇固定细胞过夜，再PI染色测细胞周期.下周我试一试，有结果就告诉你.

丁香园网友MmpRS认为：

4%多聚甲醛20分钟，4度，会增强核内GFP信号！！！！乙醇有一定的淬灭，但影响还不太大。

考虑降低多聚甲醛浓度。。不知道你的实验现在怎么样了？

丁香园网友maoliping70认为：

我用70%乙醇-20度一固定过夜，PI染色做细胞周期，结果挺好的，好象不要考虑GFP引响，因为PI与GFP检测波长不同。