Northern Blotting反应

北方杂合反应的步骤主要包括：

（1） 加入核酸探针，使与固定于尼龙膜上的特定RNA 进行杂合反应；

（2） 待杂合反应结束后以含盐缓冲液与SDS 洗掉非专一性结合于尼龙膜上的核酸探针。 进行反应时应注意下列几个问题：

a. 实验操作过程仍应尽可能避免RNase 的污染；

b. 反应前应先进行杂合前置反应（prehybridization），以便减少核酸探针与尼龙膜的间的非专一性结合反应；

c. 如果所使用的核酸探针是以random priming 或PCR 等方法所制备的双股DNA 探针，使用前务必先加热变性；

d. 选用适当的严苛度 （stringency） 进行杂合反应及后续的转印膜漂洗工作，以便增强杂合反应讯息，并减少噪声，这主要可以从温度与盐浓度两个方面加以考量。

仪器用具：Crosslinker （Stratalinker 1800, Stratagene）；塑料盒；平端镊子；封口机；42℃恒温槽；60℃恒温槽

药品试剂：6×SSC （0.9 M NaCl, 90 mM sodium citrate）尼龙膜；Hybridization solution [formamide, 50% （v/v）； 5×SSC; blocking reagent, 2% （w/v）；N-lauroylsarcosine, 0.1% （w/v）； SDS, 0.02% （w/v）]3MM 滤纸；2×SSC, 0.1% SDS;0.1×SSC, 0.1% SDS

方法步骤：

1） RNA 转印步骤结束后，移除电泳胶上的吸水纸与3M 滤纸。

2） 把尼龙膜连同电泳胶一齐移置于干净卫生纸上，并请小心维持电泳胶与尼龙膜的相对位置。

3） 以防水笔在尼龙膜上标出电泳胶样本孔的位置，并以剪刀剪掉尼龙膜左上角，以便标记电泳胶的左右方位。

4） 小心地拉开尼龙膜，将的放置于6×SSC （20 mL） 浸泡5 min.

5） 以平端镊子夹起尼龙膜，待6×SSC 滴干的后，把尼龙膜平放于卫生纸上，风干至少30 min.与电泳胶接触的那一面应朝上。

6） 以Stratalinker 1800 进行uv 连结反应。

7） 杂合前置反应：

a） 将10 mL 杂合溶液注入一个塑料袋。

b） 把已经风干的尼龙膜移置于塑料袋内，小心地把气泡移除的后，以封口机密封好，再移至42℃恒温槽进行杂合前置反应1~2 h.