Northern Blotting反应

北方杂合反应的步骤主要包括：

（1） 加入核酸探针，使与固定于尼龙膜上的特定RNA 进行杂合反应；

（2） 待杂合反应结束后以含盐缓冲液与SDS 洗掉非专一性结合于尼龙膜上的核酸探针。 进行反应时应注意下列几个问题：

a. 实验操作过程仍应尽可能避免RNase 的污染；

b. 反应前应先进行杂合前置反应（prehybridization），以便减少核酸探针与尼龙膜的间的非专一性结合反应；

c. 如果所使用的核酸探针是以random priming 或PCR 等方法所制备的双股DNA 探针，使用前务必先加热变性；

d. 选用适当的严苛度 （stringency） 进行杂合反应及后续的转印膜漂洗工作，以便增强杂合反应讯息，并减少噪声，这主要可以从温度与盐浓度两个方面加以考量。

仪器用具：Crosslinker （Stratalinker 1800, Stratagene）；塑料盒；平端镊子；封口机；42℃恒温槽；60℃恒温槽

药品试剂：6×SSC （0.9 M NaCl, 90 mM sodium citrate）尼龙膜；Hybridization solution [formamide, 50% （v/v）； 5×SSC; blocking reagent, 2% （w/v）；N-lauroylsarcosine, 0.1% （w/v）； SDS, 0.02% （w/v）]3MM 滤纸；2×SSC, 0.1% SDS;0.1×SSC, 0.1% SDS

方法步骤：

1） RNA 转印步骤结束后，移除电泳胶上的吸水纸与3M 滤纸。

2） 把尼龙膜连同电泳胶一齐移置于干净卫生纸上，并请小心维持电泳胶与尼龙膜的相对位置。

3） 以防水笔在尼龙膜上标出电泳胶样本孔的位置，并以剪刀剪掉尼龙膜左上角，以便标记电泳胶的左右方位。

4） 小心地拉开尼龙膜，将的放置于6×SSC （20 mL） 浸泡5 min.

5） 以平端镊子夹起尼龙膜，待6×SSC 滴干的后，把尼龙膜平放于卫生纸上，风干至少30 min.与电泳胶接触的那一面应朝上。

6） 以Stratalinker 1800 进行uv 连结反应。

7） 杂合前置反应：

a） 将10 mL 杂合溶液注入一个塑料袋。

b） 把已经风干的尼龙膜移置于塑料袋内，小心地把气泡移除的后，以封口机密封好，再移至42℃恒温槽进行杂合前置反应1~2 h.

8） 核酸探针变性反应：

a） 以微量移液器小心地把PCR 产物移至新的微量离心管。

b） 将装着核酸探针的微量离心管放入沸水中加热10 min.请记得以夹子固定微量离心管的盖子，以免加热时盖子爆开。

c） 把离心管移入冰浴里静置3 min.

d） 瞬间离心后，取出已被变性的核酸探针，加到5 mL 的杂合溶液。

9） 杂合反应：

a） 剪开塑料袋一角，倒出塑料袋内杂合前置反应所使用的溶液，并加入新配的含有核酸探针的杂合溶液 （8-d）。

b） 小心移除气泡，并以封口机密封塑料袋。

c） 如前节所述将塑料袋移至42℃恒温槽，杂合反应将进行过夜。

10） 以含盐缓冲液与SDS漂洗转印膜 （Northern blot）：

a） 拿出塑料袋，塑料方盒以清水冲洗干净的后，装入80 mL [2×SSC, 0.1%SDS]. 剪开塑料袋，把尼龙膜取出放进 [2×SSC, 0.1% SDS]，于室温漂洗2 次，每次5 min.

b） 续以100 mL [0.1×SSC, 0.1% SDS] 于60℃洗2 次，每次15 min.溶液需先置于60℃恒温水槽中预热。