杂交瘤技术

杂交瘤技术是1975年Kohler和Milstein用于制备单克隆抗体而创建的一项重要技术，被誉为“免疫学 上的一次革命”。此技术被广泛用于各种单克隆抗体的制备。抗体是由B淋巴细胞分泌的，一个B淋巴细胞只能分泌一种抗体。

把B淋巴细胞和骨髓细胞融合，即可形成在体外长期存活并分泌的杂交瘤细胞，如果把单个杂交瘤细胞克隆化，扩增传代，其分泌的抗体即为高度纯一的单克隆抗体。

单克隆抗体具有高度专一性，一种单克隆抗体只能结合一种特定的抗原 决定簇。正是由于其这种高度专一性，因此被广泛用于疾病的论断和治疗，生物大分子的鉴定、定位和分离纯化，以及一些细胞器，特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离等方面, 具有极其远大的应用前景, 因此，用于制备单克隆抗体的杂交瘤技术也变得越来越重要，应用范围越来越广。

实 验 目 的

1. 掌握杂交瘤技术的基本原理和基本操作方法

2. 能运用杂交瘤技术来制备自己需要的单克隆 抗体

实 验 原 理

杂交瘤技术的建立基于以下三种关键技术。

一、动物免疫

动物体内的B淋巴细胞在特定外来抗原的刺激下，可以大量增殖变成浆细胞以分泌针对于该抗原的抗体。脾内不同的B淋巴细胞克隆可分泌针对不同抗原的抗体。当受到特定外来抗原刺激时，相应的B淋巴细胞克隆便大量增殖以分泌相应的特异性抗体。动物免疫的作用就是用特定外来抗原对动物进行一次或多次免疫，以刺激能分泌针对于该抗原抗体的B淋巴细胞大量增殖，从而得到大量产生专一的B淋巴细胞。

二、细胞融合

B淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但它在体外存活很短时间(最多两周)后即死亡;而骨髓瘤细胞不分泌任何免疫球蛋白，却能在体外长期存活。如果能将这两种细胞的特性结合起来，我们就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞。

脾脏是动物体内B淋巴细胞集中的最大免疫器官, 取出脾细胞(B淋巴细胞)和骨髓瘤细胞融合后，能产生五种细胞类型;未融合的脾细胞和骨髓瘤细胞, 自身融合的脾细胞和骨髓瘤细胞，以及脾细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。其中杂交瘤才是我们需要的，因此就要设法将此杂交瘤细胞从上述细胞混合液中挑选出来。

三、杂交瘤细胞的筛选

在细胞融合后，要从上述五种细胞中筛选出杂交瘤细胞，一般使用HAT培养进行筛选，HAT培养基中含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)三种成分。细胞的DNA合成有内源性途径(主要途径)和外源性途径(旁路途径)两种方式。

内源性途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成DNA;而外源性途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase, HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK)的催化下来补救合成DNA，HAT培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂, 能有效地阻断DNA合成的内源性途径。

B淋巴细胞具有HGPRTTK这两种酶, 因此在内源性途径被阻断后仍能利用HAT培养基中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶来合成DNA，可在HAT培养基中存活, 但B淋巴细胞是正常细胞, 故不能长期存活。杂交瘤技术中所使用和SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞为HGPRT-的TK-缺陷型, 缺乏HGPRT酶和TK酶在内源性途径被阻断后不能进行DNA的外源性合成，故不能在HAT培养基中存活。

杂交瘤细胞由于继承了B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，能够合成HGPRT酶和TK酶，故在HAT养基中能长期存活。因此将融合后的混合细胞在HAT培养基中培养两周后，只有杂交瘤细胞能存活下来，成为制造单克隆抗体的细胞源。

实 验 用 品

一、器材

1. 主要设备: 无菌室一间(或超净台一台), 普通离心机一台, 倒置显微镜一架, 酶联免疫检测仪一台, CO2恒温培养箱一台, 恒温水浴一台, 高压灭菌名锅一个。

2. 小型器材: 血细胞计数板二块, 25ml和50ml培养瓶20个, 96孔和24孔培养板各10块, 40孔酶标板20块, 50ml塑料离心管6支, 10ml玻璃离心管10支, 1ml、5ml和10ml吸管各4支, 6cm培养皿2套, 100ml和50ml培养液瓶各10个, 1ml、5ml和10ml注射器各2支, 小滴管8支, 玻璃套管4, 中、小型手术剪刀各2把, 中、小型手术镊各2把, 6号针头8个, L型6号针头2个, 500ml和1000ml杯各2个, 酒精灯一盏, 不锈钢网(55cm 200目)2块, 解剖盘2个, 培养液抽滤灭菌装置一套, 橡皮塞若干, 70%酒精棉若干。

二、材料

8~12周龄BALB/c纯系小鼠10只;SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞;灭活人轮状病毒(用作抗原)。

三、试剂

RPMI 1640培养基, 小牛血清(FCS), GKN液, 50%PEG液, HT培养液, HAT培养液, 0.5% 台盼蓝(trypan blue), 1 mol/L NaOH, 1 mol/L HCl, 包被液, 底物反应液, 辣根过氧化物酶羊(或兔)抗鼠IgG, 青霉素, 链霉素。

[附] 各种试剂配方如下：

1. RPMI 1640基本培养液

RPMI 1640粉10g, 青、链霉素各10万单位，加三蒸水最终至1000ml, 用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl将pH调至7.0，用0.22mm滤膜抽滤除菌，分装冻存备用。

2. RPMI 1640完全培养液

RPMI 1640基本培养液 80ml

无菌的灭活小牛血清(FCS) 20ml

(新鲜小牛血清在56℃灭活30min后，抽滤除菌)

3. 100×HT母液

次黄嘌呤(H) 136.1mg

胸腺嘧啶(T) 38.8mg

三蒸水 100ml

于50℃溶解后，用0.22蕀滤膜抽滤除菌，分装冻存备用。

4. 100×A母液

氨基喋呤(A) 1.76g

三蒸水 90ml

滴加1mol/L NaOH至完全溶解，再用1mol/L HCl调pH至7.5，加三蒸水至1000ml, 用0.22mm滤膜抽滤除菌，分装冻存备用。

5. HT培养液

RPMI 1640完全培养液 1000ml

100×HT母液 10ml

6. HAT 培养液

RPMI 1640完全培养液 1000ml

100×HT母液 10ml

100×A母液 10ml

7. GKN 液

配方同实验三，所不同的是需用0.22mm滤膜抽滤除菌。

8. 50% PEG(聚乙二醇)溶液

取分子量1000Da的PEG 5g 用高压灭菌溶化，冷却50℃时加入等体积已预热至50℃的无菌GKN，充分混匀后分装冻存备用。在融合时用1mol/L NaOH调pH至8.0~8.2左右。

9. 包被液

Na2CO3 1.59g

NaHCO3 2.93g

加蒸馏水至1000ml，完全溶解后置4℃保存备用。

10. PBSS-Tween20缓冲液

NaCl 8.0g

Na2HPO4.12H2O 2.9g

KH2PO4 0.2g

KCl 0.2g

Tween 20 0.5ml

加蒸馏水至1000ml，完全溶解后置4℃保存备用。

11. 底物缓冲液

A液: 0.1mol/L 柠檬酸

B液: 0.2mol/L Na2HPO4

取A液 24.3ml + B液 25.7ml，加入蒸馏水至100ml。

12. 底物反应液(使用液)

底物缓冲液 100ml

邻苯二胺(OPD) 40mg

过氧化氢(H2O2) 150ml

实 验 方 法

杂交瘤的制备一般应包括动物免疫、细胞融合及HAT筛选、抗体的检测和克隆化几个基本操作步骤。

一、动物免疫

动物免疫的方法很多，一般有常规免疫法、脾内一次性免疫法、短程免疫法和体外免疫法等。脾内一次性免疫法具有用量少、免疫程序短、不加佐剂且所得单克隆抗体的特异性较高等特点。

由于单次免疫抗原刺激后数日内就进行细胞融合，因此不存在所谓“优势克隆”的问题，从而更容易获得多种不同特异性的单克隆抗体，也能助于筛选出差别微小的两种抗原的单克隆抗体。

但该方法的缺点是，其免疫效果要等杂交瘤筛选时才明了, 因此在实验时有一定的随机性;此外对一些免疫原性较差的抗原决原簇的单克隆抗体的筛选较困难。常规免疫法比较可靠，由于在融合前能通过测定血清中的抗体滴度来证实免疫效果，因此实验成功的把握性较大。

但由于免疫动物多次反复接受相同抗原的刺激, 会使某些特定的淋巴细胞克隆大量增殖, 易形成“优势克隆”, 因此所产生单克隆抗体的种类较少, 很可能多个克隆所产生的单克隆抗体都是针对于同一个抗原决定簇的。

此外此法的免疫程序太长，费时费力。而短程免疫法和体外免疫法均各有其优缺点，在此不再介绍。在利用杂交瘤技术制备单克隆抗体时，一般采用常规免疫法。

在本实验中，我们使用人软状病毒脾内一次性免疫法来免疫动物，以达到快速简便的实验效果，也适于学生操作。具体方法如下。

1. 纯化分离已灭活的人轮状病毒，并精确定量。

2. 用戊巴比妥钠对2只10周龄的BALB/c小鼠进行麻醉，按每克体重注射0.05g戊巴比妥馀的量对小鼠进行腹腔注射，5min后小鼠即进入昏迷状态。

3. 无菌打开小鼠腹腔，暴露出脾脏，用1ml注射器将含有30ng的0.1ml抗原(人轮状病毒)液分别注射到两只小鼠脾脏内。

4. 将脾脏轻轻复位，缝合伤口，饲养备用。

5. 免疫三天后取脾细胞进行融合。

二、细胞融合及HAT筛选

细胞融合方法一般有病毒介导的细胞融合、PEG介导细胞融合及电融合等。病毒介导的细胞融合方法要涉及仙台病毒的培养和灭活，尤其是仙台病毒的培养条件要求严格，过程比较复杂，因此现在一般不使用此方法。电融合为80年代刚刚兴起的一种融合方法，它除需要昂贵的电融合仪外，另外还需要特定的技术条件。目前最常使用的融合方法是PEG介导的细胞融合方法, 该方法具有操作简便、快速省时且融合效果好等优点。本实验使用的是一种快速PEG融合方法，具体操作如下;

(一) 细胞悬液的制备(均在无菌条件下操作)

在杂交瘤技术中要使用三种细胞悬液;脾细胞悬液、SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞悬液和腹腔巨噬细胞(用作饲养细胞)悬液。

1. 脾细胞悬液的制备

取已免疫BALB/c小鼠，于免疫后第三天用眼球放血处死(收集流出血液制备阳性血清)，用70%精浸泡5min后，无菌打开腹腔，取出脾脏，去除多余的脂肪组织，用37GKN液清洗2-3次。向脾内注射0.2ml GKN液后(使脾脏膨胀以得于细胞散开)，放入培养皿中，加入5mlGKN，用L型6号针头将脾细胞轻轻挤出，用滴管吹打数次以使细胞散开成单细胞状态。用不锈钢网将此细胞悬液过滤到一个50ml塑料离心管中，再加入10ml GKN液，混匀后，1000r/min心与5min，弃上清，用10ml GKN液重新悬浮细胞，取0.1ml均匀细胞悬液进行活细胞计数，其余细胞悬液入37℃备用。

2. SP2/0-Ag14细胞悬液的制备

将SP2/0-Ag14细胞用RPMI 1640完全培养液作增殖培养，每天传代一次，连续传代3天，使细胞在融合时达到对数生长期。取3~5瓶(50ml的培养瓶)SP2/0 Ag14细胞，倾去原来的培养上清液，每瓶加入37℃ GKN液4ml，将细胞悬浮起来，收集各瓶中细胞液放入一个50ml塑料离心管中1000r/min离心5min(为省时可同脾细胞一同离心)，弃去上清液，用10ml 37℃ GKN液将细胞悬浮均匀, 取0.1ml用活细胞计数，其余悬液放37℃备用。

3. 腹巨噬细胞悬液的制备

杂交瘤细胞开始生长时, 需要有饲养细胞, 一般用腹腔巨噬细胞作为饲养细胞。

取12周龄BALB/c小鼠，拉颈处死，浸入70%酒精中消毒5min。在解剖盘中无菌打开腹部皮肤，暴露出腹膜，向腹腔中注入10ml RPMI 1640完全培养液, 按摩腹部1~2min后, 用注射器抽出腹腔液(一般可抽出8~9ml)，放入一个50ml塑料离心管中, 置37℃备用。一般一只小鼠取出的腹腔巨噬细胞可接种3~5块24孔或96孔培养板。可根据需要接种的培养板数来确定所使用饲养细胞的量。

(二) 细胞融合及HAT筛选(在无菌条件下操作)

已计数脾细胞和骨髓瘤细胞按6:1的数量

比例混合于离心管

↓

1000r/min离心5min

↓弃上清

轻弹离心管底部，使沉淀细胞松散

↓40℃预热1~2min

边摇边在45秒内匀速加工50% PEG溶液

↓

90秒内边摇边向管内加速加入37℃ GKN液

↓室温静置10min

1000r/min离心10分钟

↓

加入37℃的腹腔巨噬细胞悬液和40ml HAT培养液

↓

将细胞悬液分种于二块24孔板和96孔板

↓

37℃ 5% CO2孵箱中培养

↓

观察细胞的生长情况

↓

5天用HAT培养液半量换液10天用HT培养液半量换液

14天用HT培养液全量换液

↓

当杂交瘤细胞长满孔底面积的1/2~2/3时, 即可取培养上清液进行抗体检测

三、抗体的检测

杂交瘤技术所使用的抗体检测方法必须具有简便、快速、敏感而且能在短时间内检测大量样品的特点。常用的方法有酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence, IIF)、放射免疫法(radioimmunoassay, RIA)和双相扩散法等。

间接免疫荧光法需要使用荧光显微镜，价格昂贵，灵敏度也较低，而且不能用于可溶性抗原的抗体检测，但其优点是能进行反应的定位。放射免疫法操作较复杂，所用的液体闪烁仪及制剂价格昂贵，但其灵敏度较高。

而酶联免疫吸附法则操作简便快速、灵敏度高(0.5ng/ml)，且适于大规模操作, 它需要酶联免疫检测仪, 价格较便宜。双相扩散法操作简单，不需要昂贵仪器，实验周期也较短，但灵敏度较低，一般可用于抗体的初步检测。

在杂交瘤技术中常常使用酶联免疫吸附法和双相扩散法。下面分别介绍一下。

(一) 酶联免疫吸附法

纯人轮状病毒用包被液稀释到10mg/100ml

↓

将此浓度抗原液按每孔100ml的量分别加入40孔酶标板孔中

轻轻震荡使液体覆盖孔底

↓

4℃过夜

↓

倾去酶标板液体用PBSS-Tween20缓冲液洗涤

每次洗3min共洗3次

↓

1%小牛血清白蛋白室温下封闭30min

↓

甩去封闭液用PBSS-Tween20缓冲液洗3次，每次3min

↓

每孔加入待测杂交瘤培养上清液100ml

留出4孔加入100ml阳性血清作为阳性对照

4孔加入100ml HT培养液作为阴性对照

4孔加入PBSS-Tween20缓冲液100ml作为空白对照。

↓

加入标有辣根过氧化物酶的羊(或兔)抗鼠IgG，37℃孵育60min

↓

甩去酶标二抗液，用PBSS-Tween20缓冲液清洗5次，每次3min

↓

加入100ml邻苯二胺底物反应液，室温暗处反应30min

↓

每孔加入1滴2mol/L H2SO4以终止反应，用酶联免疫检测仪进行结果检测

(呈现棕褐色反应者为阳性反应。检测出上清液为阳性的培养板孔即为阳性孔，可进行克隆化实验)

(二) 双相扩散法

1. 用含有0.01%NaN3和1%琼脂的磷酸缓冲液倒平板, 每块9cm培养皿加18ml。

2. 用打孔器在倒好的琼脂平板上均匀打7个孔，中央一孔的孔经为4mm，周围6孔的孔经为6mm中央孔与周围孔的间距为8~10mm。

3. 中央孔加入待测的杂交瘤培养上清液至孔满，周围孔也分别加入羊(或兔)抗鼠二抗IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM的标准抗体制品至孔满。吸干待测孔中的液体后将培养皿倒置。

4. 40℃放置5~7h或37℃过夜。

5. 取出琼脂板观察结果，出现沉淀线可初步判定为免疫反应呈阳性, 另外还可根据沉淀线的位置来确定所含抗体的类型。

6. 有阳性免疫反应的培养上清液原来所在的培养孔即为阳性孔, 可进行克隆化实验。

四、克隆化 (在无菌条件下操作)

对阳性孔中的杂交瘤细胞进行克隆化培养的方法一般有有限稀释法、软琼脂平板法和显微操作法等。软琼脂平板法操作比较繁琐，特别是在大量克隆化培养时需要制备很多平板，费时费力。而显微操作法需要使用显微操纵仪，价格昂贵，而且不适于大量样品克隆化。但有稀释法却具有简便快速且适于大规模操作等优点，因此在杂交瘤细胞的克隆化操作中常常使用这种方法。有限稀释法的具体方法如下;

1. 将阳性孔中的杂交瘤细胞吹打均匀悬液，取0.1ml进行活细胞计数。

2. 用含有腹腔巨噬细胞的RPMI 1640完成全培养液对杂交瘤细胞进行梯度稀释, 使其浓度分别为每毫升50个、15个、5个细胞。

3. 把三种稀释度的杂交瘤细胞悬液分种于三块孔培养板孔中(0.2ml/孔)。

4. 置37℃ 50%CO2孵箱中培养。

5. 培养到第五天便可看到较小的细胞克隆, 待单细胞克隆长满孔底面积的1/2~1/3时，再进行抗体检测。阳性孔中的单克隆杂交细胞即为阳性克隆，所分泌的抗体即为单克隆抗体。

获得单克隆杂交瘤细胞后，可通过免疫交叉实验来确定其所分泌的单克隆抗体是不是人轮状病毒所特有的。没有交叉反应的单克隆抗体即可用于人轮状病毒的临床论断和治疗。有必要时可进行再克隆实验，以建立能稳定分泌异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

实 验 结 果

一、免疫效果的初步观察

在细胞融合前取出脾脏时，如果脾脏比正常状态明显膨大，则说明有免疫效果, 用此脾脏的脾细胞进行细胞融合成功的可能性较大;如果脾脏无明显膨大则说明免疫效果不佳，可及时终止实验，以免浪费人力物力而一无所莸。

二、融合结果的观察

细胞融合后，将培养板置倒置显微镜下观察，则可看到各种类型的细胞, 有未融合的脾细胞和SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞，也有融合细胞。在融合细胞中, 有的已完成融合过程，变成了融合细胞，有的仍然呈哑铃形，在高倍镜下仔细观察即可分辨出细胞中有两个核，可以计算一下融合率来判定融合效果。

在融合后第3~5天。便可看到SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞大量死亡。死亡细胞逐渐变得不透明，最终解体，丧失贴壁性，从孔底脱落，以换液可清除部分死亡细胞以免影响活细胞的生长。培养孔中较大的透亮细胞为杂交瘤细胞。脾细胞较小，于在融合后第14天左右开始大量死亡，经换液可去除部分死亡细胞以减少对活细胞的毒害作用。

在融合后第5天左右便有杂交瘤细胞开始分裂, 从而出现一些的较小的细胞克隆, 一个培养孔往往会出现多个细胞克隆。

三、克隆化结果的观察

在克隆化后第5天左右即可看到小的细胞克隆，检查培养板并标出含有单个细胞克隆的培养孔。单细胞克隆的外形应为圆形，形状非圆形的细胞团则可能不是单细胞克隆。

作 业

1. 细胞融合后，各种类型的细胞在倒置显微镜下形态如何?

2. 单细胞克隆有何形态特征? 如何判定一个细胞团是不是单克隆细胞?

思 考 题

1. 骨髓瘤细胞和脾细胞分别于融合后什么时间开始大量死亡 ? 为什么 ?

答：骨髓瘤细胞和脾细胞在融合后第3~5天开始大量死亡，原因是HAT培养基中含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)三种成分。细胞的DNA合成有内源性途径(主要途径)和外源性途径(旁路途径)两种方式。

内源性途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成DNA;而外源性途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase, HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK)的催化下来补救合成DNA，HAT培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂, 能有效地阻断DNA合成的内源性途径。

B淋巴细胞具有HGPRTTK这两种酶, 因此在内源性途径被阻断后仍能利用HAT培养基中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶来合成DNA，可在HAT培养基中存活, 但B淋巴细胞是正常细胞, 故不能长期存活。杂交瘤技术中所使用和SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞为HGPRT-的TK-缺陷型, 缺乏HGPRT酶和TK酶在内源性途径被阻断后不能进行DNA的外源性合成，故不能在HAT培养基中存活。