电泳技术简介
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电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。
电泳技术的基本原理和分类
在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积。F=QE质点的前移同样要受到阻力（F）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：F′=6πrην式中r为质点半径，η为介质粘度，ν为质点移动速度，当质点在电场中作稳定运动时：F=F′即QE=6πrην，可见，球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。除了自身状态的因素外，电泳体系中其它因素也影响质点的电泳迁移率。
电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支持体）两大类。前者包括Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。区带电泳则包括滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等。
自由电泳法的发展并不迅速，因为其电泳仪构造复杂、体积庞大，操作要求严格，价格昂贵等。而区带电泳可用各种类型的物质作支持体，其应用比较广泛。本节仅对常用的几种区带电泳分别加以叙述。
影响电泳迁移率的因素
1、电场强度
电场强度是指单位长度（cm）的电位降，也称电势梯度。如以滤纸作支持物，其两端浸入到电极液中，电极液与滤纸交界面的纸长为20cm，测得的电位降为200V，那么电场强度为200V/20cm=10V/cm。当电压在500V以下，电场强度在2～10v/cm时为常压电泳。
电压在500V以上，电场强度在20～200V/cm时为高压电泳。电场强度大，带电质点的迁移率加速，因此省时，但因产生大量热量，应配备冷却装置以维持恒温。
2、溶液的pH值
溶液的pH决定被分离物质的解离程度和质点的带电性质及所带净电荷量。例如蛋白质分子，它是既有酸性基团（-COOH），又有碱性基团（-NH2）的两性电解质，在某一溶液中所带正负电荷相等，即分子的净电荷等于零，此时，蛋白质在电场中不再移动，溶液的这一pH值为该蛋白质的等电点（isoelctric point，pI）。
若溶液pH处于等电点酸侧，即pH=pl，则蛋白质带负电荷，向正极移动。溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移率越大。因此在电泳时，应根据样品性质，选择合适的pH值缓冲液。
3、溶液的离子强度
电泳液中的离子浓度增加时会引起质点迁移率的降低。其原因是带电质点吸引相反符合的离子聚集其周围，形成一个与运动质点符合相反的离子氛（ionicatmosphere），离子氛不仅降低质点的带电量，同时增加质点前移的阻力，甚至使其不能泳动。然而离子浓度过低，会降低缓冲液的总浓度及缓冲容量，不易维持溶液的pH值，影响质点的带电量，改变泳动速度。离子的这种障碍效应与其浓度和价数相关。可用离子强度I表示。
4、电渗
在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗（electro-osmosis）。其产生的原因是固体支持物多孔，且带有可解离的化学基团，因此常吸附溶液中的正离子或负离子，使溶液相对带负电或正电。如以滤纸作支持物时，纸上纤维素吸附OH-带负电荷，与纸接触的水溶液因产生H3O+，带正电荷移向负极，若质点原来在电场中移向负极，结果质点的表现速度比其固有速度要快，若质点原来移向正极，表现速度比其固有速度要慢，可见应尽可能选择低电渗作用的支持物以减少电渗的影响。
电泳分析常用方法
（一）醋酸纤维素薄膜电泳
（二）凝胶电泳
（三）等电聚焦（IEF）电泳技术
（四）其他电泳技术
1、IEF/SDS-PAGE双向电泳法 1975年O′Farrall等人根据不同组份之间的等电点差异和分子量差异建立了IEF/SD
S-PAGE双向电泳。其中IEF电泳（管柱状）为第一向，SDS-PAGE为第二向（平板）。在进行第一向IEF电泳时，电泳体系中应加入高浓度尿素、适量非离子型去污剂NP-40。蛋白质样品中除含有这两种物质外还应有二硫苏糖醇以促使蛋白质变性和肽链舒展。IEF电泳结束后，将圆柱形凝胶在SDS-PAGE所应用的样品处理液（内含SDS、β-巯基乙醇）中振荡平衡，然后包埋在SDS-PAGE的凝胶板上端，即可进行第二向电泳。IEF/ SDS-PAGE双向电泳对蛋白质（包括核糖体蛋白、组蛋白等）的分离是极为精细的，因此特别适合于分离细菌或细胞中复杂的蛋白质组分。
2、毛细管电泳
Neuhoff等人于1973年建立了毛细管均一浓度和梯度浓度凝胶用来分析微量蛋白质的方法，即微柱胶电泳，均一浓度的凝胶是将毛细管浸入凝胶混合液中，使凝胶充满总体积的2/3左右，然后将其揿入约厚2mm的代用粘土垫上，封闭管底，用一支直径比盛凝胶的毛细管更细的硬质玻璃毛细管吸水铺在凝胶上。聚合后，除去水层并用毛细管加蛋白质溶液（0.1～1.0μl，浓度为1～3mg/ml）于凝胶上，毛细管的空隙用电极缓冲液注满，切除插入粘土部分，即可电泳。
目前毛细管电泳分析仪的诞生，特别是美国生物系统公司的高效电泳色谱仪为DNA片段、蛋白质及多肽等生物大分子的分离、回收提供了快速、有效的途径。高效电泳色谱法是将凝胶电泳解析度和快速液相色谱技术溶为一体，在从凝胶中洗脱样品时，连续的洗脱液流载着分离好的成分，通过一个连机检测器，将结果显示并打印记录。高效电泳色谱法既具有凝胶电泳固有的高分辨率，生物相容性的优点，又可方便地连续洗脱样品。
各电泳法，除另有规定外，照下述方法操作。
一、纸电泳法
1、仪器装置包括电泳室及直流电源两部分。
常用的水平式电泳室装置包括两个电泳槽A和一个可以密封的玻璃（或相应材料）盖B；两侧的电泳槽均用有机玻璃（或相应材料）板C分成两部分；外格装有铂电极（直径0.5～0.8cm）D；里格为可放滤纸E的有机玻璃电泳槽架F，此架可从槽中取出；两侧电泳槽A内的铂电极D经隔离导线穿过槽壁与外接电泳仪电源相连。
电源为具有稳压器的直流电源，常压电泳一般在100～500V，高压电泳一般在500～10000V。
2、操作法
（1） 电泳缓冲液枸橼酸盐缓冲液（pH3.0） 取枸橼酸（C6H8O7·H2O）39.04g与枸橼酸钠（C6H5Na3O7·2H2O）4.12g，加水4000ml，使溶解。
（2） 滤纸
取色谱滤纸置1mol/L甲酸溶液中浸泡过夜，次日取出，用水漂洗至洗液的pH值不低于4，置60℃烘箱烘干，备用。可按需要裁成长27cm、宽18cm的滤纸，或根据电泳室的大小裁剪，并在距长度方向一端5～8cm处划一起始线，每隔2.5～3cm处做一记号备点样用。
（3） 点样
有湿点法和干点法。湿点法是将裁好的滤纸全部浸入枸橼酸盐缓冲液（pH3.0）中，湿润后，取出，用滤纸吸干多余的缓冲液，置电泳槽架上，使起始线靠近阴极端，将滤纸两端浸入缓冲液中，然后用微量注射器精密点加供试品溶液，每点10μl，共3点，并留2个空白位置。
干点法是将供试品溶液点于滤纸上，吹干、再点，反复数次，直至点完规定量的供试品溶液，然后用喷雾器将滤纸喷湿，点样处最后喷湿，本法适用于稀的供试品溶液。
（4） 电泳
于电泳槽中加入适量电泳缓冲液，浸没铂电极，接通电泳仪稳压电源挡，调整电压梯度为18～20V/cm，电泳约1小时45分钟，取出，立即吹干，置紫外光灯（254nm）下检视，用铅笔划出紫色斑点的位置。
（5） 含量测定
剪下供试品斑点和与斑点位置面积相近的空白滤纸，剪成细条，分别置试管中，各精密加入0.01mol/L盐酸溶液5ml，摇匀，放置1小时，用3号垂熔玻璃漏斗滤过，也可用自然沉降或离心法倾取上清液，按各药品项下的规定测定吸收度，并按吸收系数计算含量。
二、醋酸纤维素薄膜电泳法
1、仪器装置电泳室及直流电源同纸电泳。
2、试剂
（1） 巴比妥缓冲液（pH8.6）取巴比妥2.76g，巴比妥钠15.45g，加水溶解使成1000ml。
（2） 氨基黑染色液取0.5g的氨基黑10B，溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。
（3） 漂洗液取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml，混匀。
（4） 透明液取冰醋酸25ml，加无水乙醇75ml，混匀。
3、操作法
（1） 醋酸纤维素薄膜
取醋酸纤维素薄膜，裁成2cm×8cm的膜条，将无光泽面向下，浸入巴比妥缓冲液（pH8.6）中，待完全浸透，取出夹于滤纸中，轻轻吸去多余的缓冲液后，将膜条无光泽面向上，置电泳槽架上，经滤纸桥浸入巴比妥缓冲（pH8.6）中。
（2） 点样与电泳
于膜条上距负极端2cm处，条状滴加蛋白含量约5%的供试品溶液2～3μl，在10～12V/cm电位梯度下电泳。电泳区带距离以4～5cm为宜。
（3） 染色电泳完毕，将膜条取下浸于氨基黑染色液中，2～3分钟后，用漂洗液浸洗数次，直至脱去底色为止。
（4） 透明将洗净并完全干后的膜条浸于透明液中10～15分钟，取出平铺于洁净的玻板上，干后即成透明薄膜，可于分光光度计上测定和作标本长期保存。
（5） 含量测定未经透明处理的醋酸纤维素薄膜电泳图可按各药品项下规定的方法测定，一般采用洗脱法或扫描法，测定各蛋白质组分的相对百分含量。
洗脱法将洗净的膜条用滤纸吸干，剪下供试品溶液各电泳图谱的电泳区带，分别浸于1.6%的氢氧化钠溶液中，振摇数次，至洗脱完全，于一定波长下测定吸收度。同时剪取与供试品膜条相应的无蛋白部位，同法操作作对照。先计算吸收值总和，再计算各蛋白组分所占百分率。
4、扫描法
将干燥的醋酸纤维素薄膜用色谱扫描仪通过反射（未透明薄膜）或透射（已透明薄膜）方式在记录器上自动绘出各蛋白组分曲线图，横坐标为膜条的长度，纵坐标为吸收度，计算各蛋白组分的百分含量。亦可用微机处理积分计算。
三、琼脂糖凝胶电泳法
1、仪器装置 电泳室及直流电源同纸电泳。
2、试剂
（1） 醋酸-锂盐缓冲液（pH3.0） 取冰醋酸50ml，加水800ml混合后，用氢氧化锂调节pH至3.0，再加水至1000ml。
（2） 甲苯胺蓝溶液取甲苯胺蓝0.1g，加水100ml使溶解。
3、操作法
（1）制胶
取琼脂糖约0.2g，加水10ml，置水浴中加热使溶胀完全，加温热的醋酸-锂盐缓冲液（pH3.0）10ml，混匀，趁热将胶液涂布于大小适宜（2.5cm×7.5cm或4cm×9cm）的玻璃板上，厚度约3mm，静置，待凝胶结成无气泡的均匀薄层，即得。
（2） 标准品溶液及供试品溶液的制备照各药品项下规定配制。
（3） 点样与电泳
在电泳槽内加入醋酸-锂盐缓冲液（pH3.0），将凝胶板置于电泳槽架上，经滤纸桥浸入缓冲液。于凝胶板负极端分别点样1μl，立即接通电源，在电压梯度约30V/cm，电流强度1～2mA/cm的条件下，电泳约20分钟，关闭电源。
（4） 染色与脱色取下凝胶板，用甲苯胺蓝溶液染色，用水洗去多余的染色液至背景无色为止。
四、聚丙烯酰胺凝胶电泳法
1、仪器装置
通常由稳流电泳仪和圆盘或平板电泳槽组成。其电泳室有上、下两槽，每个槽中都有固定的铂电极，铂电极经隔离电线接于电泳仪稳流挡上。
2、试剂
（1）溶液A 取三羟甲基氨基甲烷36.6g，四甲基乙二胺0.23ml，加0.1mol/L盐酸溶液48ml，再加水溶解并稀释至100ml，置棕色瓶内，在冰箱中保存。
（2）溶液B 取丙烯酰胺30.0g、次甲基双丙烯酰胺0.74g，加水溶解并稀释至100ml，滤过，置棕色瓶内，在冰箱中保存。
（3）电极缓冲液（pH8.3） 取三羟甲基氨基甲烷6g、甘氨酸28.8g，加水溶解并稀释至1000ml，置冰箱中保存，用前稀释10倍。
（4）溴酚蓝指示液 取溴酚蓝0.1g，加0.05mol/L氢氧化钠溶液3.0ml与90%乙醇5ml，微热使溶解，加20%乙醇制成250ml。
（5）染色液 取0.25%（W/V）考马斯亮蓝G<[250]>溶液2.5ml，加12.5%（W/V）三氯醋酸溶液至10ml。
（6）稀染色液 取上述染色液2ml，加12.5%（W/V）三氯醋酸溶液至10ml。
（7）脱色液 7%醋酸溶液。
3、操作法
（1）制胶取溶液A2ml，溶液B5.4ml，加尿素2.9g使溶解，再加水4ml，混匀，抽气赶去溶液中气泡，加0.56%过硫酸铵溶液2ml，混匀制成胶液，立即用装有长针头的注射器或细滴管将胶液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管（10×0.5cm）中，使胶层高度达6～7cm， 然后徐徐滴加水少量，使覆盖胶面，管底气泡必须赶走，静置约30分钟，待出现明显界面时即聚合完毕，吸去水层。
（2）标准品溶液及供试品溶液的制备照各药品项下的规定。
（3）电泳
将已制好的凝胶玻璃管装入圆盘电泳槽内，每管加供试品或标准品溶液50～100μl，为防止扩散可加甘油或40%蔗糖溶液1～2滴及0.04%溴酚蓝指示液1滴，也可直接在上槽缓冲液中加0.04%溴酚蓝指示液数滴，玻璃管的上部用电极缓冲液充满，上端接负极、下端接正极。调节起始电流使每管为1mA，数分钟后，加大电流使每管为2～3mA，当溴酚蓝指示液移至距玻璃管底部1cm处，关闭电源。
（4）染色和脱色
电泳完毕，用装有长针头并吸满水的注射器，自胶管底部沿胶管壁将水压入，胶条即从管内滑出，将胶条浸入稀染色液过夜或用染色液浸泡10～30分钟，以水漂洗干净，再用脱色液脱色至无蛋白区带凝胶的底色透明为止。
（5）结果判断将胶条置灯下观察，根据供试品与标准品的色带位置和色泽深浅程度进行判断。
相对迁移率 供试品和标准品的电泳区带有时可用相对迁移率（R'<[m]>）进行比较。其计算式如下：
扫描 将清晰的胶条置双波长薄层扫描仪或凝胶电泳扫描仪中扫描并积分，由各组分的峰面积计算百分含量。
五、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白分子量，是根据大多数蛋白都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的负电荷，消除了不同蛋白分子的电荷效应，使蛋白分子相对迁移率（R'<[m]>）的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子量的标准蛋白的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的分子量。
1、仪器装置除另有规定外，同聚丙烯酰胺凝胶电泳。
2、试剂
（1）丙烯酰胺液溶称取丙烯酰胺22.2g与双丙烯酰胺0.6g，溶于100ml水中，贮于褐色瓶中低温保存。
（2） 凝胶缓冲液称取磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）8.82g 、磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）51.55g与十二烷基硫酸钠2.0g，加水至1000ml（若有沉淀析出，可加温至37℃溶解）。
（3）电泳缓冲液将凝胶缓冲液稀释1倍。
（4）染色液称取25mg考马斯亮蓝R<[250]>，溶于57%乙醇与9.2%醋酸混合液100ml中。
（5）脱色液取无水乙醇75ml，加冰醋酸50ml，用水稀释至1000ml。
3、操作法除下列规定外，其他均同聚丙烯酰胺凝胶电泳。
（1）制胶用丙烯酰胺溶液-凝胶缓冲液-水-1.6%过硫酸铵溶液-四甲基乙二胺（需冷却）（10.1∶15.0∶3.4∶1.5∶0.045） 配制而成。
（2）标准蛋白溶液及供试品溶液的制备 取标准蛋白，加水制成每1ml中含2～5mg的溶液，与水解液（取尿素21.6g和十二烷基硫酸钠0.04g，溶于40ml水中）1∶3混合，置冰箱中过夜。供试品照上述方法配制。
（3）电泳调节电流使每管为8mA。
4、相对迁移率和分子量计算 将电泳脱色后的区带用卡尺或用扫描定位法测量染料移动的距离、染色前胶条长度、蛋白移动距离和脱色后的胶条长度。按下式计算相对迁移率：
以R'<[m]>为横坐标，已知分子量标准蛋白的对数为纵坐标，在半对数坐标纸上绘图，由标准曲线中查出供试品分子量。
