qPCR 荧光染料的选择

实时定量技术，是指在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，具有特异性强、自动化程度高等特点。因此已得到广泛应用。目前我们用的最多的就是SYBRGreenI（Molecular probes）和EvaGreenTM (BIOTIUM, USA) 这两种荧光染料。

EvaGreen荧光染料与SYBRGreenI相比有以下几点优势：

1、对PCR的抑制性小

使用EvaGreenTM进行的qPCR实验可以使用快速PCR步骤。同时EvaGreenTM染料在实验中可以使用较高的浓度，从而获得远强于SYBRGreen1的扩增信号。较高浓度的EvaGreenTM Dye也消除了“染料重分布”的缺陷，使EvaGreenTM既可以用于多重PCR,也可用于高分辨率溶解曲线分析（HRM）。该分析正被越来越多的用于PCR后的基因分析和异源双链分析。由于SYBRGreenI对PCR有抑制性，从而要求其使用浓度必须很低，因此SYBRGreenI无法解决由低浓度造成的染料重分布问题，既不能用于多重PCR也不能用于HRM。同时，染料重分布问题有可能影响常规溶解曲线的可靠性，因为熔点低的DNA链可能由于这种原因而无法检测到。

2、可直接做高分辨率熔解曲线分析

熔点曲线的测定主要是为了检测产物是否是特异性目的产物。我们知道DNA双链的碱基组成不同,熔点温度不同。当到达产物的熔点温度导致DNA双链打开时,与双链结合的荧光染料释放致荧光值降低，LightCycler会根据在不同温度测得的荧光值绘制出一条熔点曲线。如果反应体系和条件优化的很好，引物的特异性很高，PCR产物纯度高，则熔点曲线的熔点峰窄且尖，如果产物不纯，有非特异性反应产物及引物二聚体，则熔点峰范围宽或有几个峰。

3、超强的稳定性

EvaGreenTM的稳定性超强。在正常的储存、运输和PCR过程中不会被破坏。EvaGreenTM有良好的热稳定性和水解稳定性，为常规操作提供了便利。在缓冲液中的染料可以稳定的储存在室温或冰箱中，也可反复冻融。与之相反，SYBRGreenI不够稳定且降解后对PCR抑制性更强。

4、安全，对人体无害

EvaGreenTM降低了细胞膜的透性，独立实验室的测试结果显示，EvaGreenTM既没有诱变性也没有细胞毒性，经过美国环境安全检测，及艾姆斯检测结果显示其安全，无毒性。而SYBRGreenI本身的诱变性很弱，但其是小分子极易透过细胞膜渗透结合人体核酸物质，在细胞中可能会抑制正常DNA的修复机制引起诱变。

EvaGreenTM是绿色荧光核酸染料。它的诸多特点使它可以用于多种应用，包括：qPCR，高分辨率DNA熔解曲线（HRM）分析，常规的DNA定量以及毛细管电泳。当染料和DNA结合后，其激发和发射光谱与荧光素（FAM）以及SYBRTMGreen I相似。这使得该染料可以直接用于配置了488nm氩离子激光器或者此光谱区域内任何可见光激发装置的仪器。EvaGreenTM本身没有荧光，但和dsDNA结合后能发出高亮度的荧光，这种特性使它特别适合于实时定量PCR（qPCR）的应用。

EvaGreenTM20×溶液专为qPCR设计。当使用热启动Taq聚合酶时，需要对PCR缓冲液中离子强度和pH值进行调整以充分发挥EvaGreen的优点。例如，使用化学修饰的Taq聚合酶，如AmpliTaqGold，可能需要降低KCl浓度同时升高Tris浓度。另外，水溶性溶剂，如DMSO或者甘油，常被用来作为添加剂以稳定master mix。这些组分以及pH值需要根据您所选用的聚合酶的特性进行优化。如果您使用常规非热启动Taq聚合酶，并配合EvaGreenTM使用，您将会获得比SYBRGreen I更优的实验结果。

由于各种仪器的光学设置不同，以及EvaGreenTM的波长略长于SYBRTMGreen I，因此当和SYBRTMGreen I平行比较时，在不同仪器上的Ct值会有＋1或－1的微小差别。然而无论您使用哪种仪器，EvaGreenTM在qPCR和熔解曲线分析中的荧光强度都远强于SYBRTMGreen