花粉母细胞涂抹制片技术

一、 实验目的

以固定的玉米幼雄穗为材料，了解花粉母细胞的取材和固定方法，学习减数分裂的基本制片技术，提高学生的动手能力。

二、实验 原理

植物花粉形成过程中，花药内的某些细胞分化成小孢子母细胞（2n），每个小孢子母细胞进行两次连续的细胞，产生四个细胞，每个细胞就是下一个单核花粉(即小胞子)，这时小胞子内细胞核的染色体数目已减少一半，成为单倍体(n).

在花粉细胞4减数高峰期采集植物的幼穗，经固定液固定进行压片染色，就可以在显微镜下观察到小孢子母细胞的形成花粉粒时的减数分裂过程，对小孢子母细胞分裂过程的观察，可以了解植物生殖细胞形成过程，进行染色体组型分析及分析各种不育的染色体原因。

涂抹制片法是细胞遗传学研究中常用的细胞学方法之一，它是将经予处理(或不经过)的植物组织或器官的细胞涂抹成一薄层，然后用染色法染色作成观察标本的速成制片法，此法操作简便、省时、效果又好，不仅可以做成立即观察的临时制片，也可以经过一系列的手续做成永久片。

细胞遗传学通常应用此法制片，研究遗传物质载体---细胞染色体的行为等问题。

三、实验材料

玉米雄穗

四、实验方法与步骤

1、材料的取样、固定和保存

（1） 取样

准确地选取实验材料，是制片能否成功的关键环节之一。要选择减数分裂活动较旺盛的小花作为观察材料。为了获得较多的合适的分裂细胞，不同植物的取材时间又有不同。由于植物花粉母细胞减数分裂的时期往往与某些外部形态有一定的相关性。

因此，可根据特定的外部形态选取比较适宜的实验材料，例如玉米，在抽穗季节于雄穗尖端露出剑叶前7-10 厘米取样，这时可用手指由喇叭口向下挤捏叶鞘，捏到有松软感时候既是雄花序所在部位，然后用刀片纵向划一缺口。取出数条花序检查，如先端小穗颖长 3-4 毫米时，就可取样。

小麦旗叶叶枕与旗叶下第一叶枕距1—5厘米时，正是小麦孕穗期，也是花粉母细胞减数分裂比较集中的时期。

（2 ）固定和保存

材料进行固定的目的，在于尽杀死细胞，适之保持采集时的分裂状态，以便进行观察研究。因此，在取样时，应尽快将材料投入固定液中，固定液种类很多，可根据材料研究目的而定。

观察花粉母细胞减数分常用醋酸---酒精系固定液。在这种固定液中，醋酸能固定核蛋白质，而且渗透力强，具有使组织膨胀、软化的作用；酒精能凝固蛋白质，有使组织收缩、硬化的作用，二者混合使用相互取长补短，达到杀死固定的目的。

固定的方法是：

取样后立即投入固定液中，并摇动瓶子使固定液迅速深入材料的组织、细胞中。固定液的用量，一般为材料的10倍。固定时间1—24小时。固定液只能使用一次，而切要现配现用，不能存放。

材料固定后若不立即制片观察，可用95%酒精清洗数次直至无醋酸味为止，再换入70%酒精放在阴凉处存放，一般可保存1-2星期，如放在冰箱中则可保存3-6个月或更长。

2、涂抹制片的操作

取一枚花药放在洁净的载玻片上，用解剖针横切花药，然后滴入一小滴醋酸洋红液，再盖上盖玻片。盖好盖片后，用吸水纸吸去多余的染色液，，再用铅笔的橡皮头垂直轻敲。为了加深染色，可手持载片在火焰上迅速来回烘烤几次。

3、镜检与减数分裂的观察

先在低倍镜下寻找花粉母细胞，一般花粉母细胞较大、圆形或扁圆形，细胞核大、着色较浅。而一些形状较小，整齐一致着色较深的细胞是药壁体细胞。观察到有一定分裂相的花粉母细胞后，用高倍镜观察减数分裂各时期染色体的行为和特征。

五、实验用品