制片技术

随着生物学和医学的发展，生物学染色技术也不断地改进和发展。利用组织切片染色方法所制出的标本，可以显示各种组织细胞的不同结构和形态，还可以显示细胞和组织中某些化学成分含量的变化。

组织制片及组织染色技术在医疗科学领域里占有重要地位，是教学、医学和科研中不可缺少的一个组成部分。组织学切片所需的组织，除一部分可取自人体外（如外科手术活检组织或尸检的新鲜材料），大部均取自动物。其过程包括组织（细胞）取材、固定、包埋、切片、染色、封片。

一、取材与固定

（一）组织取材

1． 动物处死　可采用麻醉法、空气栓塞法、颈椎脱臼或断头、动脉放血等（参见第9章）。
上述各种动物致死法，都要求动作迅速，及时解剖、取材与固定。

2． 取材方法

（1）根据实验要求取材：根据实验的要求首先选择动物种类，其次选择组织部位及取材的大小。取材时应熟悉组织器官的结构特点，如运动神经元应取脊髓的颈膨大和腰膨大处，胃则取胃底部。

（2）根据组织器官的结构特点选择切面方向：取材时应根据组织器官的结构特点选择切面方向，如大肠和小肠应纵切，气管和食管应横切。肾脏纵切可将肾盂、肾髓质和肾皮质完整展现。

（3）细胞取材：

①印片法常用于活检和手术标本，将病灶轻压于载玻片上，吹干固定5～10min，取出自然干燥。

②穿刺法用于淋巴、软组织、肝、肺、肾等。由于穿刺液少可直接涂于载玻片上，干燥后固定。

③沉淀法用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多、细胞少的标本。先用离心机以1500r/min离心10min取沉淀涂片，干燥后固定。

④细胞可直接培养在盖玻片上，也可制成细胞悬液，涂片固定后染色。

（4）注意事项：

①材料新鲜。最好是动物的心脏还在跳动时取材，所取组织立即投入固定液内。脏器的上皮组织易变质，应争取在死后半小时内处理完毕。

②组织块力求小而薄，一般标本，厚约0.2～0.3cm，大小以1.5cm×1.5cm×（0.2～0.3）cm为宜；用于免疫组化染色的组织块，以1cm×1cm×0.2cm为好；对于冰冻切片，组织块略厚，可达0.3～0.4cm。

③取材动作要轻柔迅速，避免挤压组织。切取组织块用的刀、剪要锋利，切割时不可来回挫动，应避免使用有齿镊。取材时，组织块可稍大一点，以便于在固定后，将组织块的不平整部分修去。

④尽量保持组织的原有形态。新鲜组织经固定后，或多或少会产生收缩现象，甚至完全变形。可将组织展平尽可能维持原形。对神经、肌肉、皮肤等组织则可将其两端用线扎在木片或硬纸片上固定。

⑤保持材料的清洁。组织块上如有血液、污物、黏液、食物、粪便等，先用生理盐水冲洗，然后再投入固定液。

（二）固定

1． 固定的目的和意义　将组织浸入某些化学试剂，使细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构和位置，这一过程称为“固定”。任何组织切片时，先将组织充分固定后，才能进行制片，尤其是石蜡切片，这是不可少的重要步骤。

固定的作用在于：

①防止离体组织、细胞自溶与腐败，保持组织、细胞与生活时相似的形态和结构；

②使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变成不溶性物质，使其保持原有的结构；

③使组织中的各种物质沉淀、凝固后产生不同的折射率，形成光学上的差异，以便染色后易于观察和鉴别；

④固定剂有硬化作用，可增加组织硬度，便于制片；

⑤保存抗原及DNA、RNA，特别是准备用于做免疫组化染色和核酸原位杂交的标本，及时而恰当的固定尤其重要。

2． 常用的固定方法

（1）浸泡固定法：浸泡法是组织固定的常用固定方法。方法是先在取材前配好固定液，分装于小容器内，在容器上做上标记。如一个容器内放入组织较多时，应给每个组织做好表记，以便包埋时辨认。固定液的用量应是样品的10倍以上，以保证组织充分固定。固定时间应根据固定和组织类型及染色要求而定。

（2）蒸气固定法：用于小而薄的标本，常用锇酸或甲醛蒸气固定。适用于血液或细胞涂片及某些薄膜组织的固定。

具体操作时，在培养皿滴入少量1%～2%锇酸水溶液或甲醛液，将涂片放置其中。固定20s至1min左右，水洗后进行染色、封片。

（3）注射、灌注固定法：适用于组织块体积过大或固定液难以渗入内部，或需要对整个脏器甚至整个动物进行固定。

①局部灌注固定。如肺可将固定液从气管或支气管注入，注入速度不宜太快，用力要均匀，以免肺泡破裂。眼球则可从眼后方注入固定液。肝、肾等脏器则可从肝、肾动脉注入固定液，并切断静脉以便血液排出，使固定液充分浸入。

脑的固定，须在动物麻醉后，暴露颈动脉，以注射针尖向着头部的方向注入固定液，液体的出口可开在颈静脉或左心房上。

②较大动物的固定。如兔、猫、狗、猴及整个人体，往往采用输液方法。将固定液从一侧颈总动脉或股动脉输入，将另一侧静脉切开放血，即输入固定液与放血同时进行。固定液的输入量因个体不同而异。兔、猫约为500～1000ml，猴、狗约为1000～2000ml。固定液输入后，不必即刻取材。

小动物，如大、小鼠，在麻醉情况下，打开胸腔，纵向切开心包膜，用纱线在动脉弓下打一松结，选用适当针头，从左心室向主动脉方向刺入，随即用纱线扎紧固定，再剪开右心耳放血。一般先用与该动物等量的生理盐水徐徐注入血管中洗涤，待流出的液体不见血时，再将固定液注入，直至动物全身僵硬。

（4）微波固定法：经过微波固定的组织，具有核膜清晰、染色质均匀、组织结构收缩小等优点，但应用时应严格控制温度，否则会影响组织固定的质量。

3． 注意事项　

①固定的组织必须新鲜。所取组织应立即投入到固定剂中，否则夏天超过4h，冬天超过24h，体积就要收缩变形，组织发生自溶。一般神经、造血组织的自溶速度较快，胰腺、胃肠道的黏膜较易发生改变。

②防止组织因固定剂的作用而发生变形，对一些柔嫩或薄的组织如神经、肠系膜等应先平摊于吸水纸上，再投入到固定剂中，可防止因蛋白质凝固而引起的变形。对含气而浮于液体表面的组织如肺等，可缚以重物使其下沉。

③固定液的用量。一般为组织块体积的10～15倍。固定时勿使组织贴于瓶底或瓶壁，影响固定剂的渗入。

④固定的时间。应根据组织的种类、性质、大小，固定剂的种类、性质、渗透力的强弱以及固定时的温度而定。有些固定剂对组织的硬化作用较强，固定时间不宜过长，但有些固定剂固定时间稍长也无关系，一般固定时间为3～24h左右，然后保存于70%乙醇中。

⑤固定的温度。大多数可在室温（25℃）固定，在低温（如4℃）固定时，应相应延长固定时间。

（三）固定液

用于固定组织的化学物质称为固定液或固定剂。固定剂的种类很多，由单一化学物质组成者称为固定剂或单纯固定液；由多种化学物质混合组成者称为混合固定液或复合固定液。

1． 单纯固定液

（1）甲醛（formaldehyde）：为无色气体，溶于水为40%甲醛水溶液，也称为福尔马林。

易挥发且有强烈刺激性气味，放置时间过长易产生白色沉淀“三聚甲醛”，经过滤后可用，这种溶液中有甲酸产生，可影响细胞核染色，因此需要长期保存的甲醛溶液应加入适量的碳酸镁或碳酸钙作为中和剂。一般作为固定剂的甲醛浓度为10%，以10ml原液加入90ml的水配制而成，此液中甲醛的实际浓度为4%。

甲醛水溶液渗透力强，固定均匀，组织收缩较小。

能使组织硬化并增加组织的弹性，因甲醛为非沉淀性固定剂，不能使白蛋白结合蛋白沉淀但可与蛋白质化合，对脂肪、神经及髓鞘的固定效果很好，也可以固定高尔基体、线粒体，是糖的保护剂。但经甲醛固定的陈旧组织，尤以多血的脏器如脾和肝等，较易发生黑色或棕黑色的色素沉淀。

（2）乙醇（酒精，alcohol）：为无色液体，可与水在任何比例下相混合，易被氧化为乙醛和乙酸，不能与铬酸、重铬酸钾和锇酸等强氧化剂合用，固定浓度以80%～95%为宜。它具有固定、硬化、脱水等作用，可用于糖原固定。

对已用固定液固定的组织，可用70%乙醇较长时间保存。乙醇既经济又有固定、脱水作用，但渗透力较弱。能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，前两者所产生的沉淀不溶于水，后者所产生的沉淀溶于水。

50%以上浓度的乙醇可溶解脂肪和类脂体，所以固定脂肪、类脂体物质时，不能用乙醇固定。乙醇还可以溶解血红蛋白和损害多数其他色素。因此，固定组织内的色素时不宜用乙醇作固定剂。

（3）醋酸（acetic acid）：纯醋酸为带有刺激性气味的无色液体，低于15℃时常为结晶状，称为冰醋酸。

固定组织常用5%溶液，醋酸不能沉淀白蛋白、球蛋白，但能沉淀核蛋白。5%的醋酸pH值在2～8之间，可抑制细菌和酶的活性，因此可避免自溶。醋酸的穿透力强，不能保存糖，也不能固定脂肪及类脂。在固定线粒体及高尔基复合体时忌用高浓度醋酸。

（4）苦味酸（picric acid）：为黄色结晶，是一种强酸，易燃易爆。它在水中的溶解度随室温而变化，常配制成饱和水溶液储藏。苦味酸能沉淀一切蛋白质，对脂肪、类脂无固定作用。它的渗透力较弱，一般很少单独使用。

苦味酸有软化皮肤的作用，因此皮肤组织用苦味酸或其混合液固定时，易于制作完整切片，无硬化现象。用苦味酸固定液固定组织不宜超过24h，时间过长对苏木精等碱性染料染色不利。固定后的组织块应立即转入70%乙醇中，经一定时间洗去苦味酸。为了加快其脱黄过程，往往在乙醇中滴入少量饱和碳酸锂水溶液或浓氨水。

2． 混合固定液

（1）乙醇-甲醛液（A-F液）：95％或无水乙醇（A）90ml，40％甲醛（F）10ml。此液有固定兼脱水作用，固定后可直接入95％乙醇继续脱水。适用于皮下组织中肥大细胞的固定。

（2）Carnoy液：无水乙醇60ml，冰醋酸10ml，氯仿30ml。此液穿透能力强，能很好地固定胞浆和染色质，特别适合固定外膜致密的组织，在固定组织的同时能溶解大部分脂肪。此液亦适用于糖原及尼氏体的固定，显示DNA、RNA的效果好。小块组织固定1～2h即可。

（3）Bouin液：饱和苦味酸水溶液75ml，甲醛水溶液25ml，冰醋酸5ml。冰醋酸、甲醛水溶液与饱和苦味酸的比例为1∶5∶15。它是实验室常用固定剂，用于固定大多数的器官和组织。其渗透力强，对组织固定均匀且收缩较小，染色效果好。

其中冰醋酸能固定染色质，苦味酸能使组织适当硬化，甲醛水溶液可调节前两种试剂对组织的膨胀作用。固定时间以12～24h为宜，固定后常以70％～80％乙醇洗涤。为了清除固定后组织块上的黄色，可在洗涤乙醇中加入少量的饱和碳酸锂水溶液。

Bouin液也可用乙醇配制：80％乙醇150ml，甲醛水溶液60ml，冰醋酸15ml与结晶苦味酸1g组成。此液必须临用前配制，比Bouin原液渗透力强，固定时间为24h左右，固定后可直接转入95%乙醇。

（4）Zenker液：升汞5.0g，重铬酸钾2.5g，蒸馏水100ml（100ml以上为Zenker贮存液），冰醋酸（用时加）5ml。配制此液时可将升汞、重铬酸钾一起置于蒸馏水中，加温至40℃～50℃使其溶解，过滤冷却后，存于棕色瓶内，成为储存液。

用时取此液95ml，加入冰醋酸5ml 即可，pH值为2.3。Zenker液为形态学研究常用的固定剂，适用于固定多种组织，能使细胞核和细胞质染色较为清晰，固定时间12～36h。加热固定可以加快渗透作用，固定后流水冲洗12h，在70％乙醇脱水过程中加入碘液（0.5％碘酒）以去除汞。

（5）中性甲醛：是以pH7.2～7.4的磷酸缓冲液（PBS液）为溶剂配制的甲醛溶液，浓度同前。中性甲醛的固定效果及对组织抗原性的保存均优于一般的甲醛溶液，是人体和实验动物组织最常用的固定液。

　　二、组织的脱水、透明、浸蜡、包埋

（一）组织脱水

1． 脱水的目的和原则　组织经固定水洗后，含有大量水分，水与石蜡不能融合，所以组织在浸蜡和包埋前必须经过脱水。借用某些溶剂逐步置换组织内水分，以利于透明剂、石蜡、火棉胶的渗入，这一过程叫脱水。

2． 常用脱水剂的使用方法

（1）乙醇：脱水能力强，并能使组织硬化，其缺点是易使组织收缩、变脆。为避免组织收缩过度，一般脱水从70％乙醇（人体组织从75％）开始，由低向高梯度脱水。对小动物、胚胎及柔软的结缔组织块，可从30％开始。脂肪组织和疏松结缔组织应延长脱水时间，在95％乙醇中水分必须洗净，脂肪必须溶解掉。

脱水时间应根据组织块的大小、性质和类型分别安排，一般的脱水顺序是：70％、85％、90％、95％Ⅰ、95％Ⅱ乙醇各一次、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、无水乙醇Ⅲ各一次。

（2）丙酮（acetone）：脱水作用比乙醇强，但对组织块的收缩较大，故少用于一般组织的脱水，主要用于快速脱水或固定兼脱水。脱水时间为1～3h。

（3）正丁醇（nbutyl alcohol）：为无色液体，微溶于水，故脱水能力较弱。但能与水、乙醇及石蜡混合，可直接浸蜡包埋。最大优点是很少引起组织块的收缩与变脆。一般是组织块经固定及冲洗后依次入50％、70％、80％乙醇中脱水，然后转入正丁醇12～24h。

（4）叔丁醇（tert butyl alcohol）：是异丁醇的一种，无毒，可与水、乙醇、二甲苯等混合，也可单用，是一种使用较广的脱水剂。此液优于正丁醇，不会使组织收缩或变硬，不必经过透明剂，可直接浸蜡。电镜标本制作时常用作中间脱水剂。

（二）组织透明

1． 透明的目的　为使石蜡浸入组织块，组织脱水后，必须经过一种既能与乙醇相结合又能溶解石蜡的溶剂，经过这种溶剂的媒介作用，达到石蜡进入组织块的目的。当组织中全部为透明剂占有时，光线可以透过。组织可呈现不同程度的透明状态，此种现象称为组织透明。

2． 透明剂的种类和使用方法

（1）二甲苯（xylene）：是常用的常规透明剂，易挥发、无色透明液体，折光率为1.50。长期使用对呼吸道黏膜有刺激作用，其透明能力强，易使组织收缩、变脆，故组织块在二甲苯中不宜久留，小动物组织材料必须严格控制时间。也常用于切片染色后的透明，不会使苯胺染料褪色。

（2）甲苯(toluene)：性质同二甲苯，但透明较慢，时间比二甲苯长一倍，不易使组织变脆。

（3）氯仿（chloroform）：即三氯甲烷，透明力比二甲苯差，透明时间有时长达24h，不易使组织变脆变硬，能溶于醇、醚、苯等，微溶于水，极易挥发，多用于大块组织（1cm）的透明。

（三）组织浸蜡

1． 浸蜡的目的和方法　组织经透明后用熔化的石蜡渗入到组织内部，使其变硬以利于切片和观察，这个过程称为浸蜡。用其他浸透剂（如火棉胶、碳蜡、明胶等）渗入组织内部的过程可称为浸透或透入。

浸蜡的方法为：将组织块经二甲苯透明后，立即投入到熔化的石蜡中去，组织块必须经过2～3次纯石蜡，使石蜡中剩余透明剂完全去尽，以免影响切片质量。浸蜡时间一般2～4h甚至更长，基本上与组织固定时间成正比。

总之对不同种类的组织，所用的浸蜡时间不同。石蜡熔点为56℃～58℃，恒温箱的温度总是控制在比蜡的熔点高2℃～3℃。在组织块更换蜡杯时要有一定的时间间隔，尽量减少组织内含有的二甲苯被带入最后的纯石蜡杯中去，以免影响浸蜡程度。

2． 浸透剂的种类

（1）石蜡（paraffin wax）：石蜡有高熔点和低熔点之分，常用熔点为56℃以上的石蜡。低熔点在54℃以下，用于酶的显示和保存抗原活性。一般采用熔点为56℃～58℃的石蜡比较适合。经过透蜡的组织包埋后有利于组织切片的连续性、平展性，使组织结构成分保存完好，特别适合整个蜡块的保存。

（2）火棉胶（celloidin）：为三硝基纤维素的商品名，由浓硝酸和浓硫酸作用于脱脂棉而得，易燃烧但不易爆炸，易溶于纯乙醇及乙醚的等量混合液中，也可溶于丙酮及丁香油等。目前使用火棉胶透入组织较少，而用于染色前的覆盖液较多，将原装5%火棉胶液再稀释成5%～7%浓度，作为组织切片覆盖液。

（3）碳蜡（carbowax）：为水溶性的油蜡，为多乙烯二醇。使用时以分子量为准，分子量100为液态，600为软膏状，1000以上有各种不同的硬度。

（4）明胶（gelatin）：有片型及粉型，均以浅黄色的质量较好。

（四）组织包埋

组织块经过浸透剂（石蜡、火棉胶、碳蜡、树脂等）浸透，用包埋剂（石蜡、火棉胶、碳蜡和树脂等）包起的过程称包埋。

1． 石蜡包埋法　石蜡是各种组织制片技术中极重要且应用最广的包埋剂。包埋石蜡使用前须在温箱内经多次熔化，用新蜡和陈旧蜡混合或加入蜂蜡熔化后过滤，其熔点为56℃～58℃间较为理想。

包埋组织块较为方便的是采用两块“L”形金属框相对合，其中间所留空间即可倒入熔化的石蜡。用加温后的镊子将浸蜡的组织块放置于包埋框内的石蜡中，此时应注意组织的切面朝下并放平整。石蜡的温度不应过高而损害组织，过低则使组织和石蜡不适宜而影响切片。

组织包埋好后，等到石蜡凝固，将包埋框打开，用刀片把组织蜡块切开，待完全冷却变硬后再修整蜡块，要求组织外围的石蜡保留2～3mm，以利于连续切片。

2． 体液标本石蜡包埋法　对于体液（痰液、胃液、尿液、腹水和胸水等）标本，如需要也可用石蜡进行包埋和切片。如痰液标本，选取其中含有血液的部分或可疑的实体部分，用擦镜纸包好，用10％中性甲醛固定后，经脱水、透明和浸蜡即可包埋。

新鲜胃液、尿液、腹水和胸水等标本，先去除上面的澄清液体，将下面混浊的液体放入离心管中，以2000～3000r/min离心，15min后倒去上清液，用10％中性甲醛固定下面的沉淀物，固定后处理同上。

3． 快速石蜡包埋法　本法适用于快速诊断、蜡块太小或太碎、无法使用冷冻切片方法制片时。取材要薄，主要步骤如下：将薄小组织块投入40％甲醛10ml、95％乙醇85ml、冰醋酸5ml的混合固定兼脱水液中2min。

然后入2次丙酮（3min/次），再入二甲苯2min，浸石蜡中5min。快速包埋后进行冷却切片、烤片、脱蜡至水、染色及封固。

4． 火棉胶包埋　火棉胶包埋法适用于大块组织的包埋（如神经组织和眼球等），可避免纤维组织和肌肉组织的过度硬化，减少纤维组织的收缩和扭转，利于保持组织的原有结构。缺点是操作过程太久，不宜临床外科病理和尸检制片。

主要步骤如下：

①将组织块经固定和水洗后浸入70%乙醇中6～24h。

②浸入80％乙醇中6～24h。

③浸入90％乙醇中6～24h。

④浸入95％乙醇中12～24h。

⑤浸入100％乙醇中12～24h。

⑥浸入乙醚和无水乙醇等量混合液24h。

⑦浸入2％火棉胶液（即2g火棉胶溶解于50ml纯乙醇和50ml乙醚混合液）中24h 。

⑧浸入4％火棉胶液（即4g火棉胶溶解于50ml纯乙醇和50ml乙醚混合液）中24h至数周。

⑨浸入8％火棉胶液（即8g火棉胶溶解于50ml纯乙醇和50ml乙醚混合液）中24h。

⑩浸入16％火棉胶液中1周。{11}包埋时，以足量16％火棉胶液倒于平底平皿内，将组织埋于平皿中并用盖子盖好。

包埋好的火棉胶组织块存放于70％乙醇中备用。

（五）组织脱水、透明和浸蜡时间（表17-1，17-2，17-3，17-4）

　　三、组织切片法

（一）石蜡切片法

1．切片前的准备工作　切片前应先将包埋的组织四周过多的石蜡切去，四周留约2mm的石蜡边。

一般实验室中须备以下用品：经过清洁液浸泡过的载玻片、恒温烤片机、优质狼毫毛笔（大、中号）、眼科弯镊子、毛边纸、Mdyer甘油蛋白（从新鲜鸡蛋中取出蛋白，用玻璃棒将之搅成液体，过滤，取等量甘油搅拌均匀即成。为了防腐，可在其中加数粒麝香草酚）、白胶（稀释均匀涂在载玻片上，防止组织脱片）和水浴锅。

2． 切片过程

（1）将组织蜡块装在切片机固定器上。

（2）右手旋动切片机把手，切片带出来之后，用毛笔轻轻托起，再用眼科镊以正面放入展片箱中（其温度可根据石蜡的熔点选用），摊平整后捞片。

（3）左手持清洗好的载玻片，投向水中去附贴切片，右手用镊子或毛笔辅助推动，切片被接引附贴于载玻片上后，再移至载玻片上的1/2处。

（4）切片附贴后，在空气中稍晾干，即可进行烤片。血块组织、皮肤组织需及时烤片。脑组织（人体较大组织）待完全晾干后，才能进行烤片，可防止产生气泡而影响染色。

3． 注意事项

（1）固定不当的组织染色时常出现核质着色较浅、轮廓不清、不同程度的断冲状发白区。

（2）脱水、透明和浸蜡过度会造成组织过硬、变脆。时间不充足组织块易变软，若没有适当的硬度不利于切片，染色时核浆蓝染界不清。

（3）切片出现横皱纹。常多见于组织固定不牢，或切片固定不紧。

（4）切片刀不锋利。切片时会自行卷起或皱起，更不能顺利地将切片连接成长蜡带。刀片如有缺存在，易造成切片断裂、破碎、不完整等现象。

（5）组织切片机各个零件和螺丝应旋紧，否则将会产生震动，导致切片厚薄不均。

（二）冰冻切片法

冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后进行切片。

1． 直接冰冻切片法

（1）恒冷箱切片：就是将组织在恒冷箱的切片机上切片。要求预先开动电源（预冷准备），配多种固定组织台，以便更换组织。

（2）甲醇制冷器：制冷箱为附有带导管的制冷台和制冷刀的甲醇循环装置，其冷却速度较快，作一般冰冻切片用。

（3）二氧化碳冰冻法：以二氧化碳作为冷冻剂将组织冷冻、进行切片。

（4）半导体制冷冰冻切片法：利用半导体材料控制温度，冷冻组织进行切片。

冰冷组织周围的水不宜过多，可用手指检查组织的硬度后再作切片。当能顺利切成厚薄一致的完整组织时，应迅速进行切片。用毛笔将切片取下后，放入预先准备的液体内，即可染色。

对不宜投入液体染色的组织，应用载玻片吸附法，将切片机上的组织切下留在切片机上，快速将载玻片与切片刀平行，将组织切片吸附于载玻片上。

2． 冰冻切片粘片法

（1）蛋白甘油粘片法：冰冻切片粘片法基本上按石蜡切片的粘片处理，但烘烤的温度不超过40℃。待烤干后立即取出，时间过久或温度过高则切片易破碎。烤干后用70%乙醇及蒸馏水洗后即可染色。

（2）Lillie明胶粘片法：将切片放入1％明胶水溶液数分钟，捞出置载玻片上，将多余液体倾去。入5%甲醛固定5min，水洗10min即可染色。

（3）乙醇明胶粘片法：切片浸入0.1％或0.75％明胶溶液（以40％乙醇配制）数分钟，捞于载玻片上，经室温短时干燥，投入氯仿1min，经95％及70％乙醇洗去氯仿，再经蒸馏水洗后染色。

（三）组织切片机

1． 切片机的种类

（1）石蜡切片机：能将石蜡包埋的组织切出一定厚薄的片子，都可称为石蜡切片机。石蜡切片最常用的是旋转式切片机，该机有使用方便、速度快的特点。一般由夹具（安装组织固定台）、切片刀刀架和带刻度的调节器控制切片厚度。

在使用切片机尚不熟练时，一般是先把组织块夹紧，再将调节器调至要切的厚度，然后锁上旋转重轮，使之不能转动，以免在装切片刀时误伤操作者，同时将刀片旋紧，使其不能有任何摆动。

（2）火棉胶切片机：滑动式切片机常用于火棉胶切片，有时称为火棉胶切片机。滑动式切片机对于石蜡切片、碳蜡切片均可使用，经配制冰冻附件后还可用作冰冻切片。不宜做连续切片，一般作为眼球、内耳、脊髓和脑组织切片。这种切片较厚，可以切出20～50μm厚的切片。

滑动式切片机根据台座不同，可以分为斜面式和垂直式两种类型。无论哪种类型，都是组织块夹具不动而靠滑动的切片刀来切片。斜面式滑动切片机靠切片厚度调节器，在一斜面上向上推动组织块夹具，切片刀则做水平滑动，每次经过组织块夹具上方按一定厚度切下组织片。

垂直式滑动切片机在使用上同斜面式，但组织夹具使组织块垂直上升，然后降刀在滑轮上滑行切片。

（3）冰冻切片机：冰冻切片机用于组织不经过包埋而直接进行冰冻切片。

恒冷箱切片机用于定量组织化学研究及病理诊断。后来经过改进，温度可以达到并保持在-30℃，这对组织化学研究提供了更可靠的保证。遥控恒冷箱切片适用于在尸检和外科活检的酶组织化学快速诊断，在运行过程中能自动作8～30μm的连续切片，并可以无困难地做未固定的半薄（1μm）切片。

2． 切片机的保养　组织切片机是一种较为精密的仪器，使用时必须按操作规程去做。使用后必须清洁，切勿使之生锈。每次使用时，各个可动部分的零件是否滑动自如事先都应作检查。但是不能随意拆卸零件，以防影响准确度。

对各类切片机部件应经常保持不受尘埃、水分、乙醇等沾染，每次使用后都要充分擦拭并涂以优质的机油（缝纫机油），特别是冰冻切片机更应仔细小心。对常规切片机若不经常使用，必须及时保养防止生锈、发霉。

　　四、苏木精-伊红染色

苏木精-伊红染色（hematoxylineosin staining)简称HE染色，是组织学常规制片最基本的染色方法。在HE染色的组织切片中，细胞核呈蓝色，细胞质呈红色，二者形成鲜明的对比，易于观察分析。

（一）HE染色的基本原理

1． 细胞核染色的原理　苏木精为碱性染料，可使细胞核着色。细胞核内染色质的成分主要是DNA，在DNA的双螺旋结构中，两条核苷酸链上的磷酸基向外，使DNA双螺旋的外侧带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。

2． 细胞质染色的原理　伊红是一种化学合成的酸性染料，在一定条件下可使细胞质着色。细胞质的主要成分是蛋白质，为两性化合物，细胞质的染色与染液的pH值密切相关。

当染液的pH值在胞质蛋白质等电点（4.7～5.0）以下时，胞质蛋白质以碱式电离，则细胞质带正电荷，就可被带负电荷的酸性染料染色。伊红在水中离解成带负电荷的阴离子，与胞质蛋白质带正电荷的阳离子结合，使细胞浆着色，呈现红色。

3． 分化与返蓝作用

（1）分化作用：染色后，用某些特定的溶液将组织过多结合的染色剂脱去，这个过程称为分化作用，所用的溶液称为分化液。组织切片经苏木精染色后，必须用1％盐酸乙醇分化，使细胞核过多结合的苏木精染料和细胞质吸附的苏木精染料脱去，再进行伊红染色，才能保证细胞核与细胞质染色的分明，因此在HE染色中分化是极为关键的一步。

（2）返蓝作用：分化之后，苏木精在酸性条件下处于红色离子状态，呈红色；在碱性条件下处于蓝色离子状态，呈蓝色。组织切片经1％盐酸乙醇分化后呈红色或粉红色，故分化之后，立即用水除去组织切片上的酸而中止分化，再用弱碱性水（0.2％氨水）使苏木精染上的细胞核呈现蓝色，这个过程称为返蓝作用或蓝化作用。

（二）HE染色试剂的配制

1． 苏木精染液　苏木清染液配制方法有多种，Harris苏木精染液是最常用的一种，其配方如下：苏木精1g，无水乙醇10ml，硫酸铝钾20g，蒸馏水200ml，氧化汞0.5g，冰醋酸8ml。

配制步骤：先用无水乙醇溶解苏木精，用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，再将这两种液体混合后煮沸（约1min），离火后向该混合液中迅速加入氧化汞，并用玻璃棒搅拌至染液变为紫红色（此时有大量气泡产生，故容器宜大，以防液体溢出），随即用冷水冷却至室温，然后加入冰醋酸并混匀，过滤后使用。

2． 伊红染液　伊红染液有水溶性和醇溶性两种，常用的为0.5%水溶性伊红染液。其配方如下：伊红Y 0.5g，蒸馏水100ml。
配制步骤：先用少许蒸馏水溶解伊红Y，然后加入全部蒸馏水，用玻璃棒搅拌均匀，过滤后使用（也可不过滤）。

3． 1％盐酸乙醇分化液　36％～38％盐酸1ml，75％乙醇99ml。

4． 0.2％氨水（pH值在7.5～8之间）　25％～28％氨水0.2ml，自来水100ml。

（三）染色步骤与方法

常规石蜡切片HE染色过程分为3个步骤，具体方法如下：

1． 切片脱蜡至水　①二甲苯脱蜡10min×2次。②无水乙醇洗去二甲苯1～2min×2次。③95％、90％、80％乙醇各1min，自来水洗2min。

2． 染色　①苏木精染色1～5min，自来水洗1min。②1％盐酸乙醇分化20s，自来水洗1min。③0.2％氨水返蓝30s，自来水或蒸馏水洗1min。④伊红染色20s～5min，自来水洗30s。

3． 脱水、透明、封固　①80％乙醇脱水20s，90％乙醇30s。②95％乙醇1min×2次。③无水乙醇2min×2次。④二甲苯2min×3次。⑤中性树胶或加拿大树胶封片。
染色结果：细胞核呈蓝色；细胞质、肌肉、结缔组织、红细胞和嗜伊红颗粒呈不同程度的红色。钙盐和各种微生物也可染成蓝色或紫蓝色。

（四）注意事项

1． 组织切片染色前，脱蜡应彻底，脱蜡不净是影响染色的重要原因之一。

2． 染色时间与染液的新旧程度有关，不能一成不变。新配制的染液着色力较强，染色时间可适当缩短；反之，则适当延长。伊红染色程度应以苏木精对核的着色程度为参照标准，掌握其染色时间，以达到对比鲜明为宜。

3． 伊红染液的pH值不能低于细胞核染色体等电点（pI＝3.3），否则染色体也可表现碱式电离带正电荷，而被伊红染液染色，使细胞与细胞核区分不开。因此伊红染液的pH值应小于胞浆蛋白等电点，而大于胞核染色体等电点，在3.6～4.7之间。

4． 苏木精染色后的分化处理要适度，分化过度，细胞核染色浅，形态不清；分化不足，则细胞核染色过深，影响观察。观察切片由深蓝色变成红色或粉红色时，立即将切片置入自来水中终止分化。

5． 切片染色后乙醇脱水时应从低浓度到高浓度，低浓度乙醇对伊红有分化作用，因此时间要短；而在高浓度乙醇中应逐步延长脱水时间，以免因脱水不彻底而致切片发雾，使显微镜下组织结构模糊不清。

6． 封固用的中性树胶浓度要适宜，避免产生气泡。如中性树胶过稀，容易溢出盖玻片的周围，且树胶内的二甲苯易挥发，树胶干燥浓缩后可产生气泡。如中性树胶过浓稠，滴后不易扩散，有气泡不易排出。若封固后气泡存留，既影响切片观察，又影响切片保存。

因此有气泡产生时，应轻轻按压盖玻片，将气泡驱除。封固好的切片应及时放置恒温箱中烘烤15h左右，使切片的中性树胶和盖玻片较好凝固，以减少组织损坏并有利于切片的保存。
（朱辛为　陈健康）