细胞样本的制备、固定及增加其通透性

[试剂及设备]

(1)培养基；不含酚红的DMEM培养基

(2)处理玻片：将多聚赖氨酸溶液(溶于1mol/L pH7.0 Tris-HCl缓冲液中)，涂布于玻片上，干燥后即可使用。或者APES 2ml溶于100ml丙酮中，将玻片浸泡入内，取出晾干，180℃干燥备用。

(3)洗涤液；0.1M，pH7.2～7.4PBS

(4)细胞固定液：4%多聚甲醛0.1MPBS(pH7.2～7.4)含有1/1000 DEPC

(5)乙醇：70% 90% 100%

(6)胃蛋白酶溶液：用0.1N HCl将其稀释为100μg/m

(7)设备：烤箱，CO2 培养箱，倒置显微镜，玻璃载玻片(经洗涤，180℃干烤或15磅高压灭菌20min，原位杂交专用盖玻片，温箱，加样器和吸头等。

[操作步骤]

(1)在37℃5% CO2 条件下将细胞加在处理的载玻片上，用培养基培养，时间通过预实验确定；

(2)细胞长好后，用洗涤液洗2分钟×3次，室温下将其放入细胞固定液中固定30-60min，蒸馏水洗涤；

(3)室温下用洗涤液充分洗涤固定细胞，(干燥后-20℃冰冻保存2周以上)

(4)杂交前将固定的细胞进行如下处理；依次在70%，90%，100%的乙醇中浸泡，脱水每次5min，用二甲苯洗涤，除去残留脂质依次在100%，90%，70%乙醇中浸泡，进行再水化，每次5min，最后浸泡于洗涤液中；

(5)在37℃用胃蛋白酶溶液10min处理固定的细胞，以增加细胞对大分子试剂的通透性，再用洗涤液洗5min；

(6)用1%甲醛固定10min，用洗涤液洗净。

[注意事项]

(1)所有溶液都必须用RNA酶抑制剂处理。

(2)操作中最重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响