流式细胞术应用 | 病毒细菌藻类绝对计数
贝克曼库尔特
实验简介
噬藻体是水体中常见的浮游病毒，具有控制有害藻华、调节水生态结构、以纳米尺度驱动全球生物地球化学循环、特别是碳循环的一类不可忽视的战略生物资源；异弯藻是水体中的常见藻类，在适宜的温度下会大量生长，曾在大连湾、胶州湾等曾多次形成赤潮，对异弯藻计数是水质检测中常见的检测项目。
异弯藻富含叶绿素，叶绿素在蓝光激发下有红色自发荧光；检测水体中大肠杆菌的含量，常作为水体污染指数的衡量标准。
本实验用核酸染料 SYBR green I 染色，借助 CytoFLEX 流式细胞仪对噬藻体、大肠杆菌、异弯藻进行区分，并绝对计数。与传统的显微镜计数及平板菌落计数法等相比，具有速度快，操作简便，结果准确的优点。
材料与方法
▶ 试剂
▶ 样品制备
| Sample Type | 噬藻体；大肠杆菌；异弯藻 |
| Species | 病毒；细菌；藻类 |
| Age of specimen | 新鲜样本 |
| Prep Method | 1. 准备以下四管样本：噬藻体、大肠杆菌、异弯藻、三者混合（用 TE-buffer 稀释）； 2. SYBR green I（Invitrogen，母液液为 10000×，DMSO 稀释，-20 ℃ 冰箱保存）。使用 时需要将母液稀释 200 倍使用（超纯水稀释），SYBR Green I 80°避光染色 10 min； 3. 上机检测。 |
▶ 仪器配置
| Instrument Configuration | VSSC (Yes/No) | Plate or Tube Format |
| B5-R3-V5 | Yes | Tube |
数据分析
1. 建立 FSC/VSSC-Log 双参数散点图，SYBR /VSSC-Log 散点图用于区分病毒与细菌，PC5.5/VSSC-Log 散 点图用于区分藻类；
2. 将阈值设定在 SYBR 通道，以 SYBR green I 染色的 TE-buffer 作为对照，界定阈值将杂信号去掉；
3. 分别检测以下样本：A：SYBR green I 染色噬藻体、B：SYBR green I 染色大肠杆菌、C：SYBR green I 染色 的噬藻体、大肠杆菌、异弯藻三者混合样本。
实验结果
A：SYBR green I 染色噬藻体
B：SYBR green I 染色大肠杆菌
C：SYBR green I 染色的三者混合样本
CytoFLEX 是第一台借助 VSSC 可检测 100 nm 微颗粒的流式细胞仪，在本次实验中 CytoFLEX 流式细胞仪可通 过荧光信号和 VSSC 对噬藻体病毒进行区分，并以其强大的灵敏性区分 DNA 含量不同的噬藻体与大肠杆菌。 除此之外，CytoFLEX 有自动计数功能，与用户传统方式的计数方式做比较，结果一致。
