细菌的特殊染色技术─芽孢染色 荚膜染色 鞭毛染色

一．目的要求：

学习掌握芽孢、荚膜和鞭毛染色原理和方法。

二．原理：

芽孢染色法是根据细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行染色，使芽孢和菌体呈不同颜色而便于区别。

芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，当用弱碱性染料孔雀绿在加热的情况下进行染色时，此染料可以进入菌体及芽孢使其着色，而进入芽孢的染料则难以透出。若再复染（蕃红液），则菌体呈红色而芽孢呈绿色。

观察荚膜通常采用负染色法，即将菌体染色后，再使背景着色，从而把荚膜衬托出来。

观察鞭毛是采用在染色的同时将染料堆积在鞭毛上使它加粗的方法。细菌只有在个体发育到一定的时期才具有鞭毛，一般在多次移种之后，在其旺盛生长阶段染色。

三．实验材料：

1．菌种：巨大芽孢杆菌(B.megaterium)：营养琼脂斜面培养20hs 产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)：肉汁等斜面培养20hs 普通变形杆菌(Proteus vulgaris)：营养琼脂斜面培养18hs。

2．染料：

（1）芽孢染色用7.6%饱和孔雀绿液、0.5%蕃红液（或石炭酸复红液和吕氏美蓝液）

（2） 荚膜染色用刚果红、明胶水溶液，吕氏美蓝液等。

（3） 鞭毛染色用硝酸银染色液（A、B液）;或Leifson染色液（A、B、C液）

3．其它：显微镜、载波片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、

1%盐酸、电炉、墨汁、20%CuSO 4 、95%乙醇、擦镜纸等。

四．实验方法与步骤：

（一） 芽孢染色：介绍两种常用的方法

1. 孔雀绿染色法：取一干净载片按无菌法取巨大芽孢杆菌菌体少许制成涂片，风干固定后，在涂菌处滴加法7.6%的孔雀绿饱和水溶液，染色10分钟后，

用水冲洗，再用0.5%蕃红花红液染色彩1分钟，水洗，风干后镜检。芽孢 被染成绿色，营养体呈红色。

2.石炭酸复红染色法：在一支小 试管 （1undefined100mm）中，滴入3—4滴蒸溜水，用接种环取巨大芽孢杆菌于水中，充分搅匀，使菌体分散，制成较浓的菌悬液。然后滴加等体积的(3—4滴) 石炭酸复红掖摇匀。将此 试管 放入沸 水浴 中煮10—15分钟，使芽孢及菌体着色。

取此菌液体2—3环在洁净的载片上做成涂片，自然干燥通过火焰固定后，在自来水下缓缓冲洗，使菌体脱色，再用吕氏美蓝液复染1—2分钟。用水洗去多余染液，轻轻用吸水纸吸去水分，干后镜检，结果可见芽孢被染成红色，菌体呈现蓝色。

（二）荚膜染色法

1.方法①

将刚果红水溶液和明胶水溶液各一滴滴于干净载片上；用接种环蘸取细菌培养液或悬浮液在载片上于上述两滴溶液混匀，自然干燥；滴加1%HCl冲洗，使涂片呈蓝色；用 蒸馏 水漂洗，除去HCl；，用美蓝复染1分钟，水洗，自然干燥后镜检。

镜检：有荚膜的菌，菌体蓝色，荚膜不着色，背景蓝紫色；无荚膜的菌，菌体蓝色，背景蓝紫色。由于干燥菌体收缩，菌体四周也可能有一圈狭窄的不着色环，但这不是荚膜。荚膜不着色的部分宽。

2.方法② 湿墨汁法

（1）制菌液：加一滴墨汁于洁净的波片上，并挑少量菌与其充分混合。

（2）加盖玻片：放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下 轻压，吸收多余菌液。

（3） 镜检。

结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。

3. 方法③TyLer法

（1） 涂片：按常规法涂片，在空气中自然干燥。

（2） 染色：用结晶紫冰醋酸染5—7分钟。

（3） 用20%CuSO 4 水溶液洗，再用毛边纸吸干。

（4） 镜检并观察结果：荚膜蓝紫色，细胞暗蓝色。

（三〕鞭毛染色法

1.银盐染色法

（1）清洗玻片: 选择光滑无裂痕的玻片,最好选用新的。为了避免玻片向后重叠，应将玻片插在专用金属架上。然后将玻片置洗衣粉滤过液中（洗衣粉先经煮沸，再用滤纸过滤，以除去粗颗粒），煮沸20分。

取出稍冷后即用自来水冲洗，晾干。再放入浓洗液中浸泡5—6天。使用前取出玻片，用水冲去残酸，再用 蒸馏 水洗。将水沥干后，放入95%乙醇中脱水。取出玻片，在火焰上烧去酒精，立即使用。

（2）菌液的制备及涂片：用于染色的 菌种 应预先连续移接5至7代。染色前用于 接菌的培养基应是新鲜制备的，表面较湿润，在斜面底部应有少许冷凝水。

将变形杆菌接种于肉汤斜面上，在适宜的温度下培养15至18小时后，用接 种环挑取斜面底部菌苔数环，轻轻地移入盛有1毫升与 菌种 同温的无菌水中，不要振动，让有活动能力的菌游入水中，呈轻度混浊。

在最适温度下保 温10分钟，让老菌体下沉，而幼龄菌体在无菌水中可松开鞭毛。然后从 试管 上端挑数环菌液，置于洁净玻片的一端，稍稍倾斜玻片，使菌液缓慢地流向另一端。置空气中自然干燥。

（3） 染色：

① 滴加A液，染4至6分钟。

② 用蒸馏水轻轻地充分洗净A液。

③ 用B液冲去残水，再加B液于玻片上，在微火上加热至冒蒸汽，约维持0.5至1分钟（加热时应随时补充蒸发掉的染料，不可使玻片出现干 涸部分）。

④ 用蒸馏水洗，干燥。

⑤ 镜检

结果：菌体和鞭毛呈深褐色至黑色。