单链抗体可变区基因片段五聚体作用于凋亡诱导配体受体-2来增强其对癌症的治疗作用

单链抗体可变区基因片段(scFvs) 已被看做是一类有前景的药物。然而，它们的低亲和力和快速的血浆清除率限制了其广泛的临床应用。在本研究中，我们旨在通过多聚scFv提高scFv的抗体表达，再通过与人软骨寡聚基质蛋白（COMP）48的螺旋结构域结合以抵抗死亡受体5（DR5，肿瘤坏死因子10B）。

通过合成一种五聚体，我们称其为共同体，在体外和体内实验中，scFv的活性增加了10倍，并且共同体比它的单体配对物在抗肿瘤活性方面更有效。

标准的抗体类药物正被成功地用于临床治疗癌症。然而，由于标准抗体的低产量以及生产的高成本，大肠杆菌表达的单链抗体可变区基因片段(scFv)也许能成为一类不错的可供选择的能够大规模生产的药物，尤其用于前临床研究。

然而，scFv同样具有它的缺陷，即快速的血浆清除率和对靶标的低亲和力，这严重地限制了它作为一种治疗药物的应用。

目前仅有两类scFvs在临床试验中有效（ESBA105和依芬古单抗），而大量的涉及scFvs的临床试验均被迫终止了。证据表明470kDa大小的分子具有相对延长的循环时间。

因此，当需要增加scFv的亲和力而不改变它的结合位点的特异性时，它的多聚物看起来可以成为一种有效的途径来延长它在血中的半衰期。这里有好几种方法可以用来生成多聚的scFvs。

例如，两个或更多的scFvs已经通过改变重链可变区和轻链可变区的连接肽的长度被组合成二聚体或三聚体，并且多个scFv分子已经通过化学交联被结合在了一起，例如聚乙二醇化。此外，scFvs的多聚体已经通过与多聚的结构域相结合而被合成，这些结构域包括Fc、亮氨酸拉链结构等。

最近的一篇论文指出scFv-Fc-scFv双特异性分子可以导致半衰期约460h的抗体样清除。作为一个参与细胞凋亡的关键分子，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL或载脂蛋白2配体）已经被用作一个有效的癌症治疗靶点。TRAIL是肿瘤坏死因子家族的一员。

通过形成三聚物，将它的受体聚集起来，TRAIL受体1（死亡受体（DR）4）和/或TRAIL受体2（DR 5），通过caspase级联反应引起的外源途径来诱导凋亡。

由于TRAIL对非转化细胞几乎没有细胞毒性，它要优于肿瘤坏死因子或CD95。这一优势使得TRAIL成为一个癌症治疗的理想的靶点。的确，TRAIL或针对DR4和DR5的单克隆激动性抗体目前正活跃于I/II期的临床试验，并显示了很好的癌症治疗前景。

有前景的药物都包括杜拉乐明(rhuTRAIL)、Apomab、Conatumumab/AMG 655、Tigatuzumab/CS-1008/TRA-8、Mapatumumab、Lexatumumab以及嵌合的LBY135。

在该研究中，我们旨在合成一种scFv的五聚体，它直接作用于TRAIL受体2（DR5），从而显著增加它的亲和力，正如自然的五价免疫球蛋白M分子一样。这种scFv改进的亲和力将会使这一抗体成为适合临床应用的候选药物。

之前，Zhu等人在我们实验室建立了一种通过多聚单域抗体来合成五聚抗体的方法，该抗体被称之为共同体，是通过与COMP结构域结合形成的，并展示了共同体拥有更好的亲和力。

建立在同一观念上，我们融合了一段作用于DR5的scFv来合成一个我们称之为8fC的共同体，并检测了它的结合DR5的亲和力以及在动物模型上治疗结肠癌的效果。这一8fC共同体与它的单体配对物8fM相比表现出了更高的与DR5的亲和力，它的KD值从scFv的B10–7M变成了共同体的10–11M。

皮摩尔浓度的共同体就足够诱发肿瘤细胞的凋亡，如Colo205、 A549 和HCT116。由共同体诱导的凋亡通过免疫印迹实验证实为caspase-8和caspase-3依赖性的。一个体内异种移植的肿瘤模型显示了这一共同体能够显著抑制colo105肿瘤的生长。