对流免疫电泳

对流免疫电泳是在琼脂扩散基础上结合电泳技术而建立的一种简便而快速的方法。此方法能在短时间内出现结果，故可用于快速诊断，敏感性比双向扩散技术高10~15倍。

【实验目的】

通过本实验的学习，复习巩固免疫学的基本知识，了解对流免疫电泳的基本原理及其用途，并掌握对流免疫电泳的操作步骤及技能。

【实验原理】

抗原抗体在一定的pH溶液中带有电荷，在电场的作用下可发生定向移动。将抗原抗体加入pH8.6的琼脂凝胶中，抗体只带有微弱的负电荷，而且它的分子量又较大，所以泳动慢。更重要的是抗体分子受电渗作用影响较大，也就是说电渗作用大于它本身的迁移率。

在电泳时，抗体不但不能抵抗电渗作用向正极移动，反而向负极倒退。而一般抗原蛋白带负电荷，将抗原置于负极，将抗体置于正极，电泳后则在两孔之间相遇，并在比例适当的部位形成肉眼可见的沉淀线。

【试剂与器材】

1. 抗原及相应免疫血清。

2. pH8.6　离子强度0.05M的巴比妥缓冲液配置：

巴比妥钠 10.3 g

巴比妥 1.84 g

蒸馏水 1000 ml

3. 缓冲琼脂板 将纯化的琼脂用pH8.6离子强度0.025mol的巴比妥缓冲液（用0.05mol的巴比妥缓冲液稀释一倍即可）配成1.5%的琼脂，加入0.01%~0.02%流柳汞防腐，保存冰箱内备用。

4. 其他　电泳仪、生理盐水、打孔器、微量进样器、载玻片。

【实验方法与步骤】

1.琼脂板制备　以pH8.6离子强度0.05mol巴比妥缓冲液配成1%～1.5％琼脂凝胶板，厚度2～3mm。

2. 打孔　琼脂冷却后，打成对的小孔数列，孔径0.3～0.6cm，孔距0.4～1.0cm。挑去孔内琼脂，封底。

3. 加样　一对孔中，一孔加已知（或待测）抗原，另一孔加待测（或已知）抗体。

4. 电泳　将抗原孔置于负极端。电压2.5～6V／cm，或电流强度3～5mA/cm，电泳时间30～90min。

电泳结束后，将玻板置于灯光下，衬以黑色背景观察。阳性者则在抗原抗体孔之间形成一条清楚致密的白色沉淀线。如沉淀线不清晰，可把琼脂板放在湿盒中37℃数小时或置电泳槽过夜再观察。

【注意事项】

1．　抗原抗体浓度的比例　当抗原抗体比例不适合时，均不能出现明显可见的沉淀线。所以除了应用高效价的血清外，每份待测样品均可做几个不同的稀释度来进行检查。

2．　特异性对照鉴定　为了排除假阳性反应，则在待检抗原孔的邻近并列一阳性抗原孔，若待检样品中的抗原与抗体所形成的沉淀线和阳性抗原抗体沉淀线完全融合时，则待检样品中所含的抗原为特异性抗原。

3．　适当的电渗作用在对流免疫电泳中是必要的　当琼脂质量差时，电渗作用太大，而使血清中的其他蛋白成分也泳向负极，造成非特异性反应。在某些情况，琼脂糖由于缺乏电渗作用而不能用于对流免疫电泳。

4．　当抗原抗体在同一介质中带同样电荷或迁徙相近时　则电泳时两者向着一个方向泳动。故不能用对流免疫电泳来检查。