巢式PCR与序列分析方法在确定HBV传播途径中的应用

乙型肝炎病毒（HBV）的父婴传播已讨论多年，由于HBV至今不能分离培养，研究传播仍有一定困难。本研究以巢式多聚酶链反应（PCR）与序列分析的方法研究父儿所携HBV在分子病毒学方面的特点，试图从分子水平证明HBV父儿传播的可能，并探索在病原体未分离成功的情况下研究传播的可行方法。

1. 材料与方法

1.1 研究对象

从1995年3月至1996年3月在湖南省某县以HBsAg为指标筛检前来终止妊娠的孕妇及其配偶。选择8名男性HBV携带者与其子宫内受染有胎儿为研究对象。携带者以ELISA检测常规五项HBV血清学标志与PCR检测HBV DNA确定。均无既往肝炎史，谷丙转氨酶正常，无乙肝疫苗注射史，年龄在25-35岁之间。

8名配偶以上述方法检测均无HBV感染，年龄在23-33岁之间。夫妇双方血清、白细胞、精液在住院期间收集。

取终止妊娠3月以上胎儿。胎儿血在产出当时采取并分离血清保存于-20℃，同时分离白细胞。无菌条件下取肝脏组织。胎儿血清、白细胞、肝脏任何一项HBV DNA阳性者判定为子宫内感染。另外选择5对无HBV标志的夫妇与胎儿为对照。

1.2 检测方法

1.2.1 ELISA检测HBV五项血清学标志：

HBsAg、HBeAg、抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc。

1.2.2 各种标本的处理及DNA的抽提

抗凝血液标本以白细胞分离液分离白细胞并PBS反复洗涤以除去血液中HBV DNA的影响，恢复体积分小包装低温保存备用；肝脏标本取2g与PBS2ml在无菌研磨器中研磨成匀浆PBS反复洗涤后加PBS2ml后分小包装低温保存备用；精液标本收集后离心将精子与精浆分开，精子以PBS反复洗涤以除去精浆中HBV DNA的影响，以PBS恢复体积分小包装低温保存备用。

上述标本末次洗液PCR检测HBV DNA均阴性，各种标本按常规以苯酚、氯仿、异戊醇法提取DNA。

1.2.3 PCR技术检测HBV

DNA 引物合成于中科院上海细胞所。S区与C区各设计一对套式PCR引物（表1）。第一轮PCR产物1∶50稀释作为第二轮PCR的模板，每轮PCR均设阳、阴性对照与空白对照。

1.2.4 序列分析

取S区与C区第二轮PCR产物，以醋酸胺与异丙醇纯化用Fmol DNA cycle sequencing system（promega公司）以双脱氧链末端终止法测序[3].r-32P-ATP购自北京亚辉公司。放射自显影后读片。结果输入计算机用DNASIS软件处理并与发表的序列（genebank）比较。

2.结果

表1 PCR引物序列

引物位置序列

S1R842-8225 TTAGGGTTTAAATGTATACCC3

BS156-76CCTGCTGGTGGCTCCAGTTCC

S3427-448CATCTTCTTGTTGGTTCTTCTG

BS3687-668GGCACTAGTAAACTGAGCCA

C12394-2370GGCGAGGGAGTTCTTCTTCTAGGGG

C31730-1754CTGGGAGGAGTTGGGGGAGGACATT

C21955-1974TTGCCTTCTGACTTCTTTCC

C62348-2330TAACAACAGTAGTTTCCGG

以巢式PCR检测HBV DNA54份标本阳性48份，其中8份父亲血清、2份父亲白细胞、2份胎儿血清、1份胎儿白细胞、1份胎儿肝脏、2份精液为第一轮PCR阳性，其余66.7%（32/48）均是第二轮PCR检测时出现阳性结果。尤其是5份精子标本在第一轮均阴性。共获得7份精液标本2份精子未检出HBV DNA.5例对照胎儿各种标本均无HBV感染标志。

以PCR产物直接测定6对父儿的HBV S基因第451-660位核苷酸。2对父儿的C基因第2022-2321位核苷酸（从HBV的EcoR1酶切位点计算）。6对父儿S区此段序列核苷酸同源性98%-100%。第3、4、5、6例胎儿的此段序列与父亲完全一致，其中第4对父亲血清、精子与胎儿血清HBV基因此段序列完全一致，两个位置均与原型株有差异，第499、508位原型株为C,此对父儿为A、G,此变异未引起表型变化。第1例胎儿个别碱基与父亲不同，491、494、505、544、546、581、586、592位碱基父亲为T、T、C、A、C、A、C、C，胎儿为A、A、T、C、A、T、T、T。第2例胎儿544、546位的变化与第1例相同。第491、494位的变异使胎儿S区第113、114位氨基酸由丝氨酸变为苏氨酸，546位的变异使131位氨基酸由苏氨酸变为天冬酰胺。581位的变异使第143位氨基酸由苏氨酸变为丝氨酸，其它位点均无表型变异。此段序列中父儿共同变异的5个位点即493、499、508、529、530，其中仅第3对父儿在530位由A变G，致使第126位氨基酸由苏氨酸变为丙氨酸，其它均为无表型变异。2例胎儿及父亲的C区2022~2321位核苷酸同源性100%。父儿共同变异的11个位点均为无表型变异，但是对与对之间有差异，第7对父儿2044、2049、2251、2284位为C、C、A、A而第8对父儿为T、A、G、T。

3.讨论

本研究的结果所示大部分血清标本在第一轮PCR时阳性，而组织、细胞标本大部分是在第二轮PCR出现的阳性结果，可见在含HBV DNA考贝较少的组织细胞标本中应用巢式PCR方法可提高检出率。本研究的结果初步证明父亲可能将自身携带的HBV通过精细胞传给子代，父儿间HBV基因同源性很高，尤以值得注意的是第4对父儿，父亲的血清、精子与胎儿的HBV基因所测区段完全一致，第499、508位的变化则更进一步阐明父儿传播的分子基础，父亲将分子水平特征相同的病毒传给子代。C区2022-2321区段序列父儿间同源性百分之百，未检出表型变异，可能与此区段较保守有关。但是对与对之间父儿核苷酸的差异则正好说明父儿间HBV分子水平特征相同。一般说来研究传播的常用方法是病原体分离培养与动物实验，但两者均无法进行的情况下应用PCR序列分析的方法研究传播途径是一可行的方法，也适用于新发现的传染病病原体的研究。