巢式PCR与序列分析方法在确定HBV传播途径中的应用

乙型肝炎病毒（HBV）的父婴传播已讨论多年，由于HBV至今不能分离培养，研究传播仍有一定困难。本研究以巢式多聚酶链反应（PCR）与序列分析的方法研究父儿所携HBV在分子病毒学方面的特点，试图从分子水平证明HBV父儿传播的可能，并探索在病原体未分离成功的情况下研究传播的可行方法。

1. 材料与方法

1.1 研究对象

从1995年3月至1996年3月在湖南省某县以HBsAg为指标筛检前来终止妊娠的孕妇及其配偶。选择8名男性HBV携带者与其子宫内受染有胎儿为研究对象。携带者以ELISA检测常规五项HBV血清学标志与PCR检测HBV DNA确定。均无既往肝炎史，谷丙转氨酶正常，无乙肝疫苗注射史，年龄在25-35岁之间。

8名配偶以上述方法检测均无HBV感染，年龄在23-33岁之间。夫妇双方血清、白细胞、精液在住院期间收集。

取终止妊娠3月以上胎儿。胎儿血在产出当时采取并分离血清保存于-20℃，同时分离白细胞。无菌条件下取肝脏组织。胎儿血清、白细胞、肝脏任何一项HBV DNA阳性者判定为子宫内感染。另外选择5对无HBV标志的夫妇与胎儿为对照。

1.2 检测方法

1.2.1 ELISA检测HBV五项血清学标志：

HBsAg、HBeAg、抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc。

1.2.2 各种标本的处理及DNA的抽提

抗凝血液标本以白细胞分离液分离白细胞并PBS反复洗涤以除去血液中HBV DNA的影响，恢复体积分小包装低温保存备用；肝脏标本取2g与PBS2ml在无菌研磨器中研磨成匀浆PBS反复洗涤后加PBS2ml后分小包装低温保存备用；精液标本收集后离心将精子与精浆分开，精子以PBS反复洗涤以除去精浆中HBV DNA的影响，以PBS恢复体积分小包装低温保存备用。

上述标本末次洗液PCR检测HBV DNA均阴性，各种标本按常规以苯酚、氯仿、异戊醇法提取DNA。

1.2.3 PCR技术检测HBV

DNA 引物合成于中科院上海细胞所。S区与C区各设计一对套式PCR引物（表1）。第一轮PCR产物1∶50稀释作为第二轮PCR的模板，每轮PCR均设阳、阴性对照与空白对照。

1.2.4 序列分析

取S区与C区第二轮PCR产物，以醋酸胺与异丙醇纯化用Fmol DNA cycle sequencing system（promega公司）以双脱氧链末端终止法测序[3].r-32P-ATP购自北京亚辉公司。放射自显影后读片。结果输入计算机用DNASIS软件处理并与发表的序列（genebank）比较。