补体C2的检测

一、补体C2遗传多态性的检测

人类补体C2基因位于第6号染色体短臂的HLA区，与Bf紧密连锁。C2、Bf、C4共同构成补体单倍型，C2的缺乏可导致一些疾病的发生。C2的遗传多态性主要为CundefinedC（C：common）、CundefinedB（B：basic）、CundefinedA（A：acidic）、CundefinedQO（QO：Quantify Zero）四种同种异型。

聚丙烯酰胺等电聚焦及溶血覆盖检测C2遗传多态性

1、原理 等电聚焦是根据所测蛋白质等电点的不同，将各类蛋白质分离开。C2等电点（p1）为5.5，通过等电聚焦电泳，C2条带可出现在两性电解质pH 5.2～5.7的范围内，继而加以溶血覆盖，C2条带区可出现透明溶血带，根据C2溶血带出现的区域，判别C2的同种异型。

2、所需试剂的配制

（1）Acryl sol A 牛磺酸33.30g、丙烯酰胺66.60g、双丙烯酰胺1.60g，加水至几，过滤，放棕色瓶，4℃保存；

（2）pH7.3VBS（5X） 巴比妥钠1.019g，NaCl 8.30g，先溶于150ml蒸馏水中，加HCl（1mol/L）3.46ml，最后加蒸馏水至200ml；

（3）2%明胶 明胶2g，叠氮钠0.02g溶于100ml蒸馏水中，4℃保存；

（4）GVB2+（明胶巴比妥缓冲液） VBS2+ （5X）20ml，0.03mol/L CaCl2 2ml，0.1mol/LMRCl：2ml，2%明胶10ml，加蒸馏水至100ml；

（5）GL-GVB2 GVB2+ 1份与10%葡萄糖溶液1份混合；

（6）PB pH6.0，u=0.1 NaH2P04·2H20（MW 156.01）13.17g，Na2HP04·12H20（MW358.16）1.86g，加水至1L；

（7）PBS pH6.0 0.85%NaCl 980ml，PBpH6.0/L：0.1m20ml；

（8）5X10-5mol/L 12溶液 先配制10-2mol 12溶液，称取8.3g KI，0.25g 12，加4mlpH6.0,u=0.1的PBS，待I2溶解后，再加PBSl00ml。取10-2mol l2 5ml加PBS 995ml；

（9）0.2mol磷酸 取1.35ml磷酸加水至100ml；

（10）0.2mol乙醇胺 取乙醇胺1.22ml，加蒸馏水至100ml；

（11）0.001%核黄素 称取核黄素10mg，加蒸馏水至1L，储于棕色瓶中，4℃冷藏；

（12）1%曲拉通（冷却用） 取曲拉通10ml，加蒸馏水990ml；

（13）两性电解质（ampholine，LKB） pH5～8和pH3.5～10两种；

（14）无C2人血清（R2）的制备 将3份以上正常人血清混合，1:100稀释的正常人血清，C2将不能发挥作用。

3、操作步骤

（1）制胶 将Acryl SolA 40raL,0.001%核黄素10.8ml，pH5—8的两性电解质2ml、pH3.5～10的两性电解质0.4ml混合后，倒入15X10cm，厚度为lmm的两块玻璃板中（中间夹有lmm厚的有机玻璃框，四周用铗子夹住，不漏水），放日光下或两只40W日光灯下聚胶2—5m/n，然后揭掉一块玻璃板。

（2）等电聚焦电泳

①将滤纸裁成宽0.65cm长15cm的纸条，叠成四层作为电极条，再将滤纸裁成宽0.5cm，长1cm的纸条，单层作为加样条；

②将凝胶板放在冷却循环槽上，凝胶板与冷却板之间滴加1%的曲拉通，注意不能有气泡。然后将电极条分别用0.2m01/L磷酸溶液和0.2mol/L乙醇胺浸湿。正极放置经0.2mol/L磷酸溶液浸湿的滤纸条，负极放置经0.2mol/L乙醇胺浸湿的滤纸条；

③打开冷却循环泵（LKB MulfiphorⅡ成套电泳系统），4℃循环冷却，将电极压在电极条上，接通电源100～450V预电泳30rain；

④将加样条贴在凝胶上，每个加样条加15/~L待测EDTA抗凝血浆或血清，450V电泳30min，取掉加样条，450V电泳15～18h；

⑤电泳完毕，取出凝胶板放5X10-5mol/Lh溶液中浸泡10min取出，然后用溶血覆盖技术进行鉴定，方法同C4溶血覆盖，不同的是C4溶血覆盖用的是R4豚鼠血清，C2溶血覆盖用的是R2人血清。

二、平皿法测定补体C2

将0.5%EA与缺乏C2的人血清混合，加至加热溶化后冷至50E的1%琼脂糖中混合，然后倾注于培养皿中或玻璃板上，制成2mm厚的凝胶。

用直径为2mm的打孔器打孔，然后分别将不同稀释度的参考血清及待测样本加入孔内，每孔5ul，放4℃过夜，次日再放37℃温育1-2h。将参考血清溶血环的直径（横坐标）与其含量（纵坐标）绘制标准曲线，根据标准曲线计算待测样本中C2的浓度。