DNA重组技术(Recombinant DNA)

【实验目的】

1．掌握DNA重组技术的基本原理和基本方法

2．熟悉质粒DNA的小量制备及酶切鉴定方法

【实验原理】

1．DNA重组技术
重组DNA(Recombinant DNA)技术是遗传工程的核心技术，也是人类在基因和DNA分子水平进行操作的技术。它包括以下几个步骤：

1）重组DNA分子的构建：即将目的基因（DNA或cDNA片段）与载体DNA重组，应用TA克隆方法,将PCR扩增产物快速克隆至质粒载体中。

该方法利用了PCR过程中使用的热稳定聚合酶(Taq酶)在所复制的双链分子末端加上单一脱氧腺苷酸(A),从而产生一A-粘性末端的性质,设计一种线性载体,使之含有一T-粘性末端,可直接插入PCR产物,在DNA连接酶作用下，目的DNA和载体DNA连接形成重组DNA分子。

2）将重组DNA分子转化宿主细胞。

3）克隆选择增殖：将转化后的液体涂布于琼脂培养基表面，培养基中含有宿主菌敏感的抗生素，重组DNA（TA克隆载体分子）含有相应抗生素的抗性基因，转化的细菌能在培养基上生长形成集落。挑取菌落，置液体培养基中培养，得到大量含重组DNA的细菌。

4）收获扩增后的培养细胞，提取重组DNA分子（质粒），并纯化，获得某一基因或DNA片段的大量拷贝。

2．质粒DNA的小量制备

常见的质粒DNA提取方法有简易一步提取法、碱裂解法和煮沸法。本实验采用的是碱裂解法，碱裂解法的原理：在PH 12.0~12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒（CC）DNA仍为自然状态。

将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。大部分染色体DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。通过离心，将可去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用乙醇沉淀回收质粒DNA。

3．质粒DNA的限制性内切核酸酶（限制酶）切分析

限制酶存在于原核生物体内，根据其结构和功能特性分为：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型切点不固定，Ⅲ型其切割位点在识别位点之外，只有Ⅱ型其特异性切点位置可以控制和预测，可以产生固定的DNA片段，基因工程中所用的限制酶均为Ⅱ型限制酶。

这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异性核苷酸序列的能力，能在这个特异性核苷酸序列内切断DNA双链，形成一定长度和顺序的DNA片段。

选择合适的限制酶对重组的环状质粒进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，用已知相对分子量的线状DNA（DNA分子量标志）及未经酶切的重组环状质粒为对照，可以对重组环状质粒中的目的DNA分子进行初步鉴定。

【实验用品】

1．PCR扩增仪；恒温振荡培养箱；超净工作台；细菌恒温培养箱；台式高速离心机；电热恒温水浴箱；冰箱；电泳仪； 电泳槽，样品槽模板（梳子）；紫外灯；保鲜膜；一次性塑料手套；凝胶自动成像仪。

2．三角烧瓶（500ml, 250ml,100ml）,培养皿，玻璃试管，试管塞，玻璃棒，酒精灯，镊子，脱脂棉，纱布，乙醇，容器盒。

3．微量加样器（1000μl,200μl，20μl）；Tip头（1000μl,200μl，20μl）。Tip头盒（1000μl,200μl，20μl）；Eppendorff管（2ml,1.5ml,0.5ml），Eppendorff管架。Parafilm，透明胶带。

4．DNA重组相关试剂：

1）Taq DNA聚合酶，缓冲液，dNTP，特异性引物，靶DNA；凝胶回收试剂盒；TA克隆载体：pMD18-T；感受态细菌；氨苄青霉素（100mg/ml）。

2） LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，10N NaOH调pH至7.0定容至1L。15磅高压消毒，4℃保存。

3）LB琼脂培养基：15g琼脂粉溶于1000ml LB培养基，15磅高压消毒备用。

5．质粒提取试剂：

溶液Ⅰ(10×)：0.5M葡萄糖；0.25M Tris-Cl (pH8.0)；0.1M EDTA，10磅高压消毒，4℃保存备用.

溶液Ⅱ:0.2N NaOH;1%SDS 室温贮存，即用即配。

溶液Ⅲ:3M NaOAc(pH4.8) 10磅高压消毒,室温贮存。

RNA酶 A: 10mg/ml

TE缓冲液：10mM Tris-Cl (pH7.6)，1mM EDTA(pH8.0)

6．质粒DNA的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳相关试剂：

限制性内切酶Hind Ⅲ、XbalⅠ及酶反应所需缓冲液；琼脂糖；溴化乙啶贮存液（10mg/ml）；6×载样缓冲液。

Tris-乙酸(TAE)贮存液：

50×：242克Tris碱，57.1ml冰乙酸，100ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）
加水至1L

【实验步骤】

1．PCR产物纯化
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，应用凝胶回收试剂盒回收纯化目的DNA片段。

2．目的DNA片段连接至T/A克隆载体 即重组DNA分子的构建

3．转化

3.1 将感受态细胞置冰中融解。

3.2 将60μl感受态细胞移至无菌试管内。

3.3 加入用于转化的DNA 10μl（＜10ng），轻弹管底混匀。

3.4 冰中放置30分钟。

3.5 42℃放置45~60秒，不要振荡。

3.6 冰中放置2~3分钟。

3.7 加入37℃ 预温好的LB培养基940μl（无抗生素）。

3.8 37℃振荡培养1小时（160~225 rpm）。

4．筛选及增菌

4.1 取适量涂布琼脂平板。

4.2 37℃培养过夜。

4.3 挑取菌落，放在2~5ml LB液体培养基中（含50μg/ml Amp）过夜培养（240 rpm）。

4.4 收集细菌，提取质粒。

5．质粒DNA提取

5.1 2ml 菌液以12000rpm离心1分钟。

5.2 弃上清，沉淀物溶于100μl溶液Ⅰ（1×）中，剧烈振荡，室温5分钟。

5.3 加新配制的溶液Ⅱ200μl，充分混合后冰浴5分钟。

5.4 加溶液Ⅲ 150μl，混匀冰浴5分钟。

5.5 12000rpm离心10分钟,将上清转移到另一离心管中。

5.6 加900μl（2倍体积）的乙醇，震荡混合,室温放置2分钟，沉淀双链DNA。

5.7 12000rpm离心5分钟。

5.8 小心吸去上清液,将离心管倒置于一张纸巾上,以使所有液体流出.再将附于管壁的液滴除尽。

5.9 用1ml 70%乙醇洗涤沉淀的双链DNA,按“步骤5.8”所述方法去掉上清,在空气中使沉淀的DNA干燥10分钟。

5.10 用50μl含胰RNA酶(20μg/ml)的TE重新溶解核酸,振荡,贮存于-20℃。

6．质粒DNA的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定

6.1 质粒DNA的限制性内切酶酶切

将清洁、干燥、灭菌的Eppendorff管（0.5ml）编号，用微量加样器按表1所示将各种试剂分别加入每个管内，加样后，小心混匀，置于37℃水浴消化过夜，然后65℃ 20分钟终止酶解反应。各酶切样品于-20℃贮存备用。

6.2 琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定质粒DNA酶切片段

6.2.1胶板的准备

取有机玻璃内槽，洗净晾干。取透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（注意，将透明胶带紧贴于有机玻璃内槽的两端边上，不要留空隙）。将有机玻璃内槽置于一水平位置，在距离底板0.5~1.0ml的位置放入梳子。

6.2.2琼脂糖凝胶的制备

称取0.6克琼脂糖，置于锥形瓶内，加入50ml 1×TAE，瓶口用保鲜膜封盖，在微波炉中加热直至琼脂糖全部溶解，得到1.2 %琼脂糖凝胶液，待其冷却至65℃左右，加入2.5μl溴化乙啶贮存液（10mg/ml），使溴化乙啶终浓度为0.5μg/ml。

小心混匀并倒在有机玻璃内槽中，控制灌胶速度，使胶液缓慢展开，避免产生气泡，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置1小时左右，待胶凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。将凝胶放入电泳槽中，加入恰好没过胶面1mm深的足够电泳缓冲液，预电泳10分钟。

6.2.3加样

取适量的酶切样品，加入6×载样缓冲液适量（终浓度为1×），用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内。

6.2.4电泳

加完样品后的凝胶板立即通电进行电泳，DNA带负电荷，由负极向正极移动。电场强度不高于5V/cm。当溴酚蓝染料移动到距离胶板下沿1~2cm处，停止电泳。

6.2.5观察和拍照

取出凝胶，在波长为254 nm的紫外灯下观察凝胶。DNA存在处显示出红色的荧光条带。在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或采用有机玻璃防护罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤。

以上步骤也可以用凝胶自动成像仪处理。

【实验结果分析】

1．记录DNA重组的方法。

2．观察分析经酶切质粒DNA（实验组）和未经酶切质粒DNA（对照组）琼脂糖凝胶电泳结果。