细胞凋亡的检测

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1. 早期检测：

1) PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测：PS从细胞膜 内侧转移到外侧在细胞受到凋亡诱导后不久发生，可能作为免疫系统的识别标志。

AnnexinV，一个钙依赖性的磷脂结合蛋白，能专一性的结合暴露在膜外侧的PS，再通过简单的显色或发光系统进行检测。由于这是一种凋亡早期的活细胞检测(悬浮细胞和贴壁细胞都适用)，可与DNA染料或别的晚期检测方法相结合来标记凋亡的发展阶段。　　

美国著名生物试剂公司CLONTECH和Invitrogen 公司分别开发了多种标记的Annexin V产品，简便快速，10分钟就可完成检测。其中带荧光标记的Annexin V-EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)及Annexin V-FITC，灵敏度高，可作为FACS(流式细胞分选)方法筛选凋亡细胞的基础。

由于融合蛋白Annexin V-EGFP，EGFP与PS 的结合比例为1：1，还可进行定量检测。除此之外，还提供生物素偶联的Annexin V，可通过常用的酶联显色反应来检测。另外，MACS公司将磁珠包被Annexin V，可采用磁分选方法筛选凋亡细胞。　　

2)细胞内氧化还原状态改变的检测：　　

这反应了细胞凋亡研究中相对较新的趋势，研究什么样的氧化还原环境引起下游事件的发生。CLONTECH公司的ApoAlertTM Glutathione Detection Kit通过荧光染料monochlorobimane(MCB)体外检测凋亡细胞细胞质中谷光苷肽的减少来检测凋亡早期细胞内氧化还原状态的变化。

正常状态下，谷光苷肽(glutathione：GSH)作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原。这一反应在线粒体 中尤为重要，许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。

在Jurcat和一些其它类型的细胞中，细胞膜中有可被凋亡信号启动的ATP依赖的GSH转移系统。当细胞内GSH的排除非常活跃时，细胞液就由还原环境转为氧化环境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从而使细胞色素C(三羧酸循环中的重要组分)从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反应。　　

由于 GSH与氧化还原作用及线粒体功能密切相关，此项检测除了对研究细胞凋亡的起始非常有用外，还可用于心脏病、中风等疾病治疗的研究。但有些细胞如：HeLa 和3T3细胞凋亡时没有明显的GSH水平的变化，不能用此法检测。　　

3)细胞色素C的定位检测　　细胞色素C作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞液，结合Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1)后启动caspase级联反应：细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。细胞色素C氧化酶亚单位Ⅳ(cytochrome c oxidase subunit Ⅳ：COX4)是定位在线粒体内膜上的膜蛋白，凋亡发生时，它保留在线粒体内，因而它是线粒体富集部分的一个非常有用的标志。　　

ApoAlertTMCell Fractionation Kit不用超离心，可从凋亡和非凋亡细胞中快速有效分离出高度富集的线粒体部分，再进一步通过Western杂交用细胞色素C抗体和COX4抗体标示细胞色素C和COX4的存在位置，从而判断凋亡的发生。　　

4) 线粒体膜电位变化的检测：　　

在凋亡研究的早期，从形态学观测上线粒体没有明显的变化。随着凋亡机制研究的深入，发现线粒体凋亡也是细胞凋亡的重要组成部分，发生很多生理生化变化。例如，在受到凋亡诱导后线粒体转膜电位会发生变化，导致膜穿透性的改变。

MitoSensorTM，一个阳离子性的染色剂，对此改变非常敏感，呈现出不同的荧光染色。正常细胞中，它在线粒体中形成聚集体，发出强烈的红色荧光。凋亡细胞中，因线粒体穿膜电位的改变，它以单体形式存在于细胞液中，发出绿色荧光。

用荧光显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号。CLONTECH公司的ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor Kit就采用这种原理来检测线粒体膜电位的变化。但是，这种方法不能区分细胞凋亡或其他原因导致的线粒体膜电位的变化。

2. 晚期检测

细胞凋亡晚期中，核酸内切酶(某些Caspase的底物)在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。对于这一现象的检测通常有以下两种方法：　　

1) TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling)　　

通过DNA末端转移酶将带标记的 dNTP (多为dUTP)间接(通过地高辛)或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。

美国Intergen公司提供多种标记方法，直接荧光标记，地高辛介导荧光标记或过氧化物酶联显色，可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。其中，直接标记步骤少，操作简便。而间接标记有信号放大的作用，检测灵敏度高。　　

2) LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测)　　

当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少(如活体组织切片)时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。CLONTECH公司的ApoAlert?LM-PCR Ladder Assay Kit通过LM-PCR(ligation-mediated PCR)，连上特异性接头，专一性地扩增核小体的梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生的核小体的梯度片段。此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。　　

上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征，但细胞受到其它损伤(如机械损伤，紫外线等)也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。　　

3) Telemerase Detection (端粒酶检测)　　

这是相对来说推出较早，用得较多的一种方法。端粒酶是由RNA和蛋白组成的核蛋白，它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列，使细胞获得“永生化”。正常体细胞是没有端粒酶活性的，每分裂一次，染色体的端粒会缩短，这可能作为有丝分裂的一种时钟，表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。

研究发现，90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。Invitrogen公司的TRAP-eze Telemerase Detection Kit在1996年率先推出。它提供特定的寡核苷酸底物，分别与底物及端粒重复序列配对的引物。

如果待测样本中含有端粒酶活性，就能在底物上接上不同个数的6碱基(GGTTAG)端粒重复序列，通过PCR反应，产物电泳检测就可观察到相差六个碱基的DNA Ladder现象(参见图4)。此外，Intergen公司还提供用酶联免疫法(ELISA)检测的试剂盒.　　

同样，这种检测方法也不专对细胞凋亡，检测结果也不纯反应细胞凋亡的发生。

3.mRNA水平的检测

研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。据报道，Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞(cytotoxic T cells)等靶细胞。

Bcl-2 和bcl-X (长的) 作为抗凋亡(bcl-2 和bcl-X)的调节物，它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活。一般多采用Northern杂交和RT-PCR走胶对它们进行检测。随着近年来荧光定量PCR技术的发展，用定量PCR技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确。

Invitrogen公司的Amplifluor? Apoptosis Gene Systems就根据这一新技术原理，通过检测fas,bax-alpha 和 bcl-X (长的) 基因的 mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测。

4.细胞凋亡的形态学检测

根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。　　

1.光学显微镜和倒置显微镜　　

1.1. 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。　　贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。　　

1.2. 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。　　

2.荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜　　

一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。　　

常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258),DAPI。三种染料与　DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。　　

Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。　　

DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。　　

结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。　　

3.透射电子显微镜观察　　

结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期(pro-apoptosis nuclei)的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象(cavitations)的空泡结构;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。