RNA酶A的小鼠细胞治疗

互联网2013-01-10

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一、RNA酶A的小鼠细胞治疗介绍

RNA酶A透其次是免疫细胞治疗是一种方法，它允许显示的本地化涉及到细胞的蛋白质的RNA酶敏感的结构。这项技术是高度依赖所使用的RNA酶A的质量在我们的实验室中，我们用RNA酶A的小鼠细胞治疗表明，异染色质蛋白1（HP1）在臂间异染色质蛋白的富集取决于存在一种RNA成分。

二、材料与试剂

CSK缓冲液：（在-20°C贮存）

10m M的管（pH值7.0）

100 mM的氯化钠

300 MM蔗糖

3 mM氯化镁

三、实验步骤

1. RNA酶制剂是从牛胰核糖核酸酶A是一种核糖核酸内切酶，专门切割单stranted RNA的。酶攻击嘧啶核苷酸的3'-磷酸基和劈开的5'-磷酸联动的相邻核苷酸。

RNA酶A，它工作在辅因子和二价阳离子的情况下，可以抑制由RNA酶抑制剂。对RNA酶A的选择和准备，此协议是至关重要的。核糖核酸酶A的一些公司完全适用于分子生物学的应用程序，但它不能使用的细胞，它只是杀死他们。

2. 在0.01M醋酸钠（pH5.2）中的10毫克/毫升的浓度溶解RNA酶A；加热至100℃，15分钟；允许缓慢冷却至室温；通过加入0.1倍体积的1M TrisHCl（pH7.4）中，将pH调节；分装到装店在-20°C

3. 细胞提取

为了检测在细胞核的依赖于RNA的蛋白质的相互作用，细胞首先要被提取用洗涤剂。这一步可以去除而留下更紧密地结合蛋白的可溶性蛋白。

4. 直接贴壁细胞成长到的盖玻片

洗净3分钟，在室温下用1xPBS；洗净与CSK，缓冲液 3分钟，在室温下；孵育在CSK缓冲器 + 0.5%的Triton X-100在室温下5分钟；CSK缓冲液 3分钟，在室温下洗涤；用PBS洗两次，在室温下3分钟。

5. RNaseA处理

对RNase A处理的Triton X-100通透细胞（RNA酶浓度，时间和温度），滴定实验，以确定最佳条件，用RNA酶A罗氏。显然的条件来进行调整，这不仅取决于的RNA酶，但也以被处理的细胞类型。

在PBS中加入1 mg/ml 的RNA酶A，在室温下进行10分钟；用PBS洗两次，在室温下3分钟；在PBS中的2%多聚甲醛固定15分钟，在室温；然后进行染色。特异性的RNA酶消化已知的RNA依赖的标记，如核仁纤维，分散后处理有关的蛋白质的核糖体RNA的成熟，这是已经被监控。

然而，还没有完全拧入细胞核染色几个核组分（核膜蛋白，核纤层蛋白B；剪接因子钪-35；着丝粒蛋白CENP-A，B，和C）将被保留。