氰化高铁血红蛋白测定法及红细胞计数的方法与注意事项
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本实验的主要目的是掌握氰化高铁血红蛋白测定法原理、方法与操作步骤;掌握血细胞计数板的使用和结构;了解红细胞计数的原理、方法与步骤。具体实验方法如下:
实验目的要求:
通过血红蛋白测定、红细胞计数实验要求:
1、掌握红细胞计数、血红蛋白测定的原理、方法及注意事项。
2、掌握血细胞计数板的结构
一、血红蛋白测定(Hemoglobin简称Hb)
(氰化高铁血红蛋白法)
【原理】
血红蛋白中的亚铁离子(Fe2+)被高铁氰化钾氧化成高离子(Fe3+),血红蛋白转化成高铁血红蛋白,高铁血红蛋白与氰离子(CN-)结合,生成稳定的氰化高铁血红蛋白。用光电比色计在540nm波长比色。从HicN参考液制作的标准曲线上读取血红蛋白克数。
【操作】
取试剂5毫升加入血液20ul混匀置5分钟后用721光电比色仪,540nm波长,试剂为空白调0点比色,读取光密度,查标准曲线得结果。
二、红细胞计数(red blood Cell 简称RBC)——显微镜直接计数(试管法)
【原理】
一定量的血液经一定量等渗性稀释液稀释后,充入血细胞计数池中显微镜下计数一定容积内的细胞,再换算成每升标本的细胞数报告。
【操作方法】
l、取红细胞稀释液2.0ml毫升,放入一小试管内。
2、用血红蛋白吸管吸血至l0ul处。
3、擦去管尖外部余血将血液迅速轻轻吹入盛有红细胞稀释液的试管内,吸上清液嗽洗吸管2-3次,立即摇匀。
4、用玻棒取混悬液少量,充入计数池内。
5、待2—3分钟,让红细胞完全下沉后,将计数板平放在显微镜台上,用低倍镜观察,如红细胞分布均匀即可换高倍镜进行计数。
红细胞计数的区域:
中心大方格中的5个中方格(正中一个和四角各一个)。
计数原则:
数上不数下,数左不数右的计数原则即凡压在中方格边线(双线)上的红细胞,只计上侧与左侧线上的细胞,而压在下侧与右侧线上者不计入。
<center> </center> <center> </center> <center> </center> <center> </center> <center> </center>注意事项:
1、吸管、试管要注意清洁、干燥以防溶血,操作迅速避免血液凝固,如有血凝块应重新采血。
同时做血红蛋白测定,白细胞计数和分类计数,在采血时应先做血膜再做红细胞,然后做白细胞,血红蛋白检验,避免红细胞破坏。
2、充液:
充液前,红细胞复液要充分摇匀,红细胞悬液注入计数池内要求分布均匀,不可有气泡,亦不可有多余液体外溢。
3、质量控制:
中方格内红细胞分布应均匀,健康成人每中方格红细胞数约为80—100个,各中方格内之红细胞相近,如悬殊过大(超过10个细胞以上的)应重混匀再充填。
报告方式:
Hb : g/L
RBC: ×l012/L
小结:在测定血红蛋白吸光值前,需要校准分光光度计 ,HicN参考液中KCN是剧毒物品,配制的时候一定要严格按照程序操作,避免溶液对自身的伤害。