CDNA文库筛选

CDNA 文库筛选

（一）λ gt11 cDNA 文库铺平板

宿主细菌制备

1． 用一个 E.coli 宿主菌株单菌落分别接种 2 × 5ml LB 培养基（ Y1088 用于噬菌斑杂交， Y1090 用于免疫筛选），于 37 ℃振荡培养过夜。

2． 将过夜培养物以 3000 × g 离心 5min 。

3． 分别用 2ml λ -dil （ 10 mmol/L tris-Cl,pH7.5; 10 mmol/L MgSO4 ; 高压灭菌）重悬细胞沉淀。

4． 细胞悬液可用于 4 ℃贮存至一周。

预制噬菌体悬液铺平板

以已知滴度（如，已知每 ml 噬菌体颗粒数）的 cDNA 文库或其他噬菌体悬液开始，用λ－ dil 稀释以达到所需每平板噬菌体数。每个 90mm 直径平皿 5 × 103 个噬菌体 /100 μ l 开始筛选。

铺平板

1． 将所需数量的 LB 平板置 42 ℃温箱预热。

2． LB 顶层琼脂（每平板最少 2.5ml ）用微波炉熔化，然后置 49 ℃水浴中。

3． 为温箱内的每一个平板准备一个 12ml 带螺旋盖试管，于室温，放在合适的架子上。

4． 用移液器每管加 100 μ l λ－ dil 稀释的宿主细胞悬液。

5． 每管加 100 μ l 稀释的噬菌体悬液与细菌于漩涡器上简短混合。

6． 含细菌和噬菌体（感染混合物）的试管于 37 ℃温育 25min ，然后室温放置。

7． 用一支消毒的 10ml 玻璃移液管在本生灯火焰上稍稍预热，取 2.5ml 保存在 49 ℃的熔化顶层琼脂加到一支含感染混合物的试管内。

8． 立即在手掌之间滚动混合管内混合物，然后均匀地倒入一个预热的 LB 平板上。

9． 倒好的平板于室温置水平面上直至顶层琼脂凝固（至少 5min ）。

10． 重复步骤 7 至 9 ，直至所有的细菌和噬菌体混合物都铺平板。

11． 平板置 42 ℃温箱（对λ gt11 ）直至噬菌斑长出。

（二）杂交筛选―― cDNA 序列作为探针

1． 如上述将文库铺平板，噬菌斑杂交实验用 E.coli 宿主菌株 Y1088 。

2． 噬菌斑于 42 ℃生长过夜。

3． 从温箱取出平板，置 4 ℃冷却至少 1h 。

4． 膜剥离：首先，用软铅笔在干的硝酸纤维素滤膜上给准备影印的平板编号。其次，从平板的中央开始向边缘小心将滤膜铺在菌台上。当滤膜完全变湿后（颜色变灰），再等 30s 。同时，用针头在平板上标出滤膜的 3 个不对称位置。小心将滤膜从平板上剥离，接触面向上放在一张干净的 Whatman 3MM 滤纸上。在进行下一步骤之前，所有的平板重复步骤 4 。

5． 将滤膜接触面向上漂浮在变性液（ 0.5 mol/L NaOH; 1.5 mol/L NaCl ）中 5min 。

6． 中和 5min 。

7． 用 2 × SSC 洗涤 5min 。

8． 将滤膜放在一张新的 Whatman 3MM 滤纸上，用铅箔将滤膜和滤纸一起包住。

9． 在真空炉中 80 ℃烘烤 2h 。

10． 用 6 × SSC 预先短暂地湿润滤膜，然后用预洗液（ 50 mmol/L Tris-Cl pH8.0; 1mol/L NaCl; 1mmol/L EDTA; 0.1% SDS ）于 68 ℃预洗涤至少 1h 。用一个盘子放在水浴摇床上。

11． 将 25 张滤膜转移到一个装有 50ml 杂交液（ 5 × SSPE ； 1 × Denhardt’s 液； 100 μ g/ml cT-DNA ； 0.1 ％ SDS ）的贮存罐内（直径至少 90mm ）， 68 ℃预杂交 2h 。

12． 对于每 ml 杂交液， 2 倍的 105 至 1 × 106 cpm 的双链探针经沸水浴变性 10min 后，迅速放冰上冷却。

13． 变性探针立即加到预杂交混合液中。

14． 在封口的贮存罐内于 68 ℃杂交过夜，不断地晃动以防滤膜粘在一起。

15． 杂交结束后，滤膜用 2 × SSC ， 0.01 ％ SDS 于室温洗涤 3 次约 1h 。

16． 将潮湿（防止干燥）的硝酸纤维素滤膜放在一张硬纸或 X 光片上，用放射性墨水在针头标签上作标记。

17． 滤膜用塑料包装袋（如 Saran ）包住，然后加上增感屏在 X 光片上于－ 70 ℃曝光过夜。

（三）免疫筛选

制备 Sepharose 偶联细菌裂解液

1． 各用一个 E.coli 温度敏感溶源菌株（ BTA 282 （λ gt11amp3 ）或 BNN 97 ）单菌落接种于 2 × 7.5ml 培养基并于 32 ℃生长过夜。

2． 过夜培养物用 LB 培养基稀释 100 倍，于 32 ℃生长至 OD600 值为 0.5 。

3． 于 45 ℃温育 15min 诱导噬菌体表达。

4． 培养物于 39 ℃进一步培养约 2h 。

5． 测定噬菌体含量以便收集，氯仿测定操作步骤： 3 滴氯仿加到 1ml 培养物测试样品中，混合物于 37 ℃温育。另一份不加氯仿的培养物作为平行对照。温育 5min 后，测试样品与对照比较。如果添加氯仿的测试细胞悬液清澈透明，细菌完全被吸附，刚好开始裂解，此时已可收集培养物。

6． 于 4 ℃以 4000 × g 离心 10min 收获细菌。

7． 从开始的两份 7.5ml 培养物离心得到的细胞沉淀用冷的偶联缓冲液重悬并再次离心。

8． 各用 5ml 冷的偶联缓冲液重悬细胞沉淀。

9． 超声波处理细胞悬液，直到粘度增加至不再释放出核酸。

10． 将细菌裂解物偶联到预先制备好的溴化氰活化 Sepharose 4B 于 4 ℃过夜。

11． 以 3000 × g 离心 5min 回收偶联物。

12． 用偶联缓冲液重悬沉淀并再次离心。

13． 为了饱和溴化氰活化 Sepharose 的未结合反应基团，沉淀物用冷（ 4 ℃）的饱和缓冲液重悬并在旋转轮上于 4 ℃温育 1h 。

14． 通过三次连续的洗涤除去未吸附蛋白质，开始用洗涤缓冲液（ pH4.0 ）；然后转换至 pH8.0 ；最后一次洗涤 pH 为 4.0 ，在这个处理前后和每次洗涤之间，在 4 ℃， 2500 × g 离心 5min ，收集材料。

15． Sepharose 偶联细菌裂解液可以 PBS 悬液（＋ 0.01 ％硫柳贡）于 4 ℃贮存几个星期。

用于筛选的抗体预吸附

1． 浓度为 0.5 至 1 mg/ml 未稀释的第一抗体和第二抗体（如过氧化物酶偶联羊抗兔抗体， Calbiochem 公司）分别用 1.7 倍体积的 Sepharose 偶联细菌裂解液混合，并在旋转轮子上于 4 ℃温育过夜。每次筛选循环约需要 300 μ l 已处理的第一抗体（最终工作稀释度为 1 ： 100 ）和 15 μ l 已处理的第二抗体（最终工作稀释度为 1 ： 2000 ）。

2． 悬液加到少量玻璃棉填充的加样器吸头内。未封闭抗体用冷冻封闭液（至少 5 倍于柱体积）洗脱。

3． 用冷的封闭液调节洗脱出的抗体浓度至原先浓度的 1/20 。加入硫柳汞（终浓度 0.01 ％）。

铺平板

1． 如上所述铺制平板，作如下修改：

a. 另外一支含 2.5ml 顶层琼脂的 12ml 带螺旋盖试管置 49 ℃水浴中以铺制诱导对照平板。

b. 在一份感染混合物中，用 100 μ l 噬菌体悬液含已知百分比的具有完整β - 半乳糖苷酶基因的野生型噬菌体作为诱导对照。

c. 在加相应感染混合物前，为铺制诱导对照平板 20 μ l X-gal 立即加到 2.5ml 顶层琼脂中。

2． 于 42 ℃温育 3 ～ 4h （用 E.coli Y1090 ）直至噬菌斑可见。

3． 将平板移到层流橱内，用 IPTG 浸泡过的硝酸纤维素滤膜覆盖在上面以诱导噬菌体 lacZ 基因表达。对每个平皿，用软铅笔在干的硝酸纤维素滤膜上编号，然后在平皿内用 IPTG 溶液浸泡。排去平皿边缘多余的液体，然后从平板的中央开始往边缘小心地将滤膜放在长有细菌的平板上。滤膜总是用平头镊子操作。

4． 于 37 ℃温箱倒置培养过夜。

5． 诱导对照平板上的某些噬菌斑过夜培养后，由于完整的β - 半乳糖苷酶表达将变成蓝色，表明 IPTG 诱导成功。

6． 从平板上剥离滤膜前，应该用针头在滤膜上标出 3 个不对称位置。

7． 然后小心地从平板上剥离滤膜，接触面向上放在 Whatman 3MM 滤纸上，直至所有的滤膜揭下。

免疫学染色

1． 为了洗去顶层琼脂上的残余物和细胞碎片，将硝酸纤维素滤膜一次最多 5 张转移放在摇床上的盘子（ 10 × 10cm ）内，用 25ml TBS 室温洗涤 10 min 2 次。

2． 然后滤膜用 25ml 封闭缓冲液（每张 90mm 直径的滤膜至少 15ml ）于室温温育 30min ，以封闭滤膜上的非特异性结合位点。不断晃动以防滤膜互相粘在一起。

3． 每张滤膜置佩特里平皿中，各用 3ml 含预吸附第一抗体的封闭缓冲液温育。多克隆第一抗体的经典工作稀释度为 1 ： 100 。抗体的这种工作稀释度可以重复使用到 5 次并于 4 ℃保存。室温下用第一抗体温育至少 2h 。为了确保滤膜仍然完全浸泡在抗体溶液中，温育过程中，将平皿放在摇动平台上。

4． 室温下用 25ml TBT 洗膜 3 次，每次 10min ，并不断摇动以除去未结合第一抗体。

5． 本步骤操作同步骤 3 。 3ml 封闭缓冲液内预吸附第二抗体的工作稀释度通常为 1 ： 2000 （如过氧化物酶偶联羊抗兔抗体， Calbiochem 公司）。第二抗体工作溶液使用不得超过一次。第二次使用后，第二抗体工作溶液的吸附能力似乎耗尽，经常导致阳性信号的突然丢失。

6． 用 25ml TBS 于室温下摇动洗膜 3 次，每次 10min 以除去未结合的第二抗体。

7． 在一个塑料盘内， 45ml 冷（ 4 ℃）的酶反应缓冲液与 5ml 冷（－ 20 ℃）的氯萘酚和 50 μ l H2 O2 混合。将滤膜一次最多 5 张放在显影液内并缓慢搅动。几分钟内阳性噬菌斑显示出紫红色。

8． 如果用 Polaroid 摄影术（ 665 型胶卷，光圈 4.5 ，快门速度 1/15 ，橙色滤光片）记录结果，将硝酸纤维素膜放在曝光箱内。

9． 为了有助于挑取阳性菌体斑，在拍照的透明胶片上用针头做相应的标记。

噬菌斑纯化

1． 用一支消毒的钝头巴斯德吸管刺入对应于阳性菌体斑位置的顶层琼脂，通常很容易从平板上取下薄的环状顶层琼脂并用 0.5ml λ -dil 重悬于一支 Eppendorf 管内。

2． 挑取的噬菌斑所含的噬菌体颗粒通过剧烈的旋涡振荡至少 1h ，从顶层琼脂释出，在再次铺平板前，新制备的噬菌体悬液置室温下至少 1h 。

3． 在 10 － 3 至 10 － 5 范围内稀释的噬菌体悬液重悬筛选阳性信号。

4． 重复步骤 1 至 3 ，直到从一个原始噬菌体感染在顶层琼脂上挑取一个阳性噬菌斑为止。

噬菌体增殖

1． 为了获取高滴度的均一噬菌体悬液，每个噬菌斑噬菌体悬液取 150 μ l 至 250 μ l ，加入 E.coli Y1088 铺平板以便扩增。

2． 于 42 ℃过夜培养后，每噬菌体克隆的一个平板裂解物用 7ml λ -dil 覆盖，于室温持续摇动 5h 提取噬菌体颗粒。

3． 用一支消毒的 10ml 移液管吸取含噬菌体的上清液，小心避免细胞碎片。加入几滴氯仿，上清液可作为噬菌体贮存液于 4 ℃无限期保存。

4． 每毫升悬液噬菌体原种滴度应在 109 ～ 1010 噬菌体颗粒范围内。如果噬菌体原种未包含足够的噬菌体，重复步骤 1 ～ 3 ，直至达到足够的噬菌体滴度为止。

5． 必须通过对高度稀释的噬菌体原种（最多几百个噬菌体）再次铺平板测试噬菌体原种的均一性，并用探针重新筛选。至少 99 ％的测试的噬菌体是阳性才能认定测试的噬菌体原种是“均一的”。

（四）噬菌体颗粒纯化， DNA 分离和亚克隆

1． 准备 10 个 LB 平板，用 E.coli Y1088 铺平板，每个平板至少 105 个噬菌体。 42 ℃温育过夜。

2． 含噬菌体上清液按前述方法制备，从所有平板收集上清液（ 10 × 5ml ）。

3． 将收集的上清分成两份 25ml 分装于 40ml 聚丙烯离心管内。

4． 加入 25 μ l RNA 酶 A 和 DNA 酶 I 完全消化细菌核酸，于室温放置 30min 。

5． 每管加入 1.46g NaCl 并使之完全溶解，室温放置 1h 后，于 4 ℃以 10 000r/min 离心 10 min 除去细胞碎片。

6． 将上清转入一干净 40ml 聚丙烯离心管，加入 2.5g PEG ，于室温持续搅拌 30min 使其完全溶解，置冰上过夜 PEG 促使噬菌体颗粒形成沉淀。

7． 于 4 ℃以 10 000r/min 离心 10min 回收沉淀的噬菌体颗粒。

8． 弃上清液，小心用软纸擦拭离心管内壁。

9． 将来源于同一噬菌体克隆的两份沉淀物用 4ml SM 重悬并收集。用 5ml 移液管上下抽吸使乳状沉淀物混匀。

10． 加 4ml 氯仿，旋涡振荡 30 秒，去除 PEG ；于 4 ℃以 1 600 × g 离心 15min 。

11． 将水相（顶层）转移至一干净的 12ml 聚丙烯管内，用 SM 精确地调节体积至 4ml 。弃去胶状的有机相和中间相。

12． 在一支 14ml polyallomer 超离心管（ Kontron 公司）内，氯化铯分级梯度的制备从底层至顶层： 3ml 氯化铯密度为ρ＝ 1.7 ； 1.5ml （ρ＝ 1.5 ）； 1.5ml （ρ＝ 1.45 ）。

13． 每 4ml SM 噬菌体悬液溶解 2g 固体氯化铯。

14． 将噬菌体悬液置氯化铯分级梯度上，在 Backman SW40 转头或相当的转头上以 30 000r/min 于 4 ℃离心 2h 。

15． 小心从转头内取出离心管，放在强光下。此时噬菌体颗粒清晰可见呈乳状条带位于 1.5 和 1.45 密度区的中间相。用 18G 针头从离心管旁侧刺入，以收集噬菌体颗粒。约 1.5ml 体积。

16． 用 SM 将收集的样品体积升至 6ml ，加入固体氯化铯（通常约 3g ）直到溶液的折射率精确为 1.380 。样品体积进一步用氯化铯溶液（ 0.75g/ml ）扩至终体积为 9.5ml 。

17． 噬菌体颗粒通过持续密度滴度再次离心。

18． 如步骤 15 收集噬菌体颗粒，用于以标准步骤抽提 DNA 。