LDH(乳酸脱氢酶)法细胞毒性检测
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1. 原理:LDH (乳酸脱氢酶) 是稳定的胞浆酶,存在所有的细胞中,当胞膜损伤时快速释放到细胞培养液中。 LDH 活性通过两个酶催化反应: LDH 氧化乳酸盐生成丙酮酸盐,然后丙酮酸盐和四唑盐 INT 反应生成甲( formazan )结晶。 甲( formazan )结晶量在培养液中的增加,与裂解的细胞数增加直接相关。甲( formazan )结晶染料是水溶的,可以用分光光度计在 500nm 波长检测。 通过检测细胞培养上清中 LDH 的活性,可判断细胞受损的程度此分析灵敏、方便、精确,适用于许多种细胞毒性分析。此分析大概需 0.5 - 1h 。 2. 试剂:该检测方法一般有配套的试剂盒,以400T的试剂盒为例,包括以下试剂:
3. 工作液的制备: a. 用 ddH2 O 溶解催化剂( Catalyst ) 10min ,充分混匀。催化剂溶液 4 ℃ 可保存数周。 b. 染色液( Catalyst ) 4 ℃ 可保存数周。 c. 反应混合液的制备:分析 100 assays ,混合 250ul 催化液和 11.25ml 染色液。混合液现配现用。 4. 细胞毒分析步骤: ( 1 ) 收集细胞,用 1× 分析液(如, 1 %血清或 1 % BSA 培养液)。 ( 2 ) 在 96 孔板中分别制备下列样本: 背景对照: 每孔加 200ul 培养液, 3 个复孔。背景值应从其他值中减去。 低对照: 向每孔 200ul 分析液中加 1 - 2×104 细胞, 3 个复孔。 高对照: 向每孔 200ul 含 1 % Triton X-100 的分析液中加 1 - 2×104 细胞, 3 个复孔。 检测样本: 向每孔 200ul 含检测物质的分析液中加 1 - 2×104 细胞, 3 个复孔。 ( 3 )在培养箱中( 5 % CO2 ,90% 湿度, 37 ℃ )孵育细胞,孵育时间为检测物质的适当处理时间。 ( 4 ) 离心细胞 250g , 10min 。 ( 5 ) 每孔小心转移 100ul 上清到相应的优化清洁 96 孔板中。 ( 6 ) 每孔加入 100ul 反应混合液,室温孵育 30min 。避光操作。 ( 7 ) 用微孔读板仪在 490 - 500nm 检测所有样本的吸光值。参考波长大于 600nm 。 5. 计算细胞毒的百分比: 细胞毒(%)= (检测样本-低对照) / (高对照-低对照) % |