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LDH(乳酸脱氢酶)法细胞毒性检测

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1. 原理:LDH (乳酸脱氢酶) 是稳定的胞浆酶,存在所有的细胞中,当胞膜损伤时快速释放到细胞培养液中。 LDH 活性通过两个酶催化反应: LDH 氧化乳酸盐生成丙酮酸盐,然后丙酮酸盐和四唑盐 INT 反应生成甲( formazan )结晶。


甲( formazan )结晶量在培养液中的增加,与裂解的细胞数增加直接相关。甲( formazan )结晶染料是水溶的,可以用分光光度计在 500nm 波长检测。


通过检测细胞培养上清中 LDH 的活性,可判断细胞受损的程度此分析灵敏、方便、精确,适用于许多种细胞毒性分析。此分析大概需 0.5 - 1h 。


2. 试剂:该检测方法一般有配套的试剂盒,以400T的试剂盒为例,包括以下试剂:


Components
400 assays
Catalyst(Lyophilized)
Dye Solution
1 vial
45 ml

3. 工作液的制备:


a. 用 ddH2 O 溶解催化剂( Catalyst ) 10min ,充分混匀。催化剂溶液 4 ℃ 可保存数周。


b. 染色液( Catalyst ) 4 ℃ 可保存数周。


c. 反应混合液的制备:分析 100 assays ,混合 250ul 催化液和 11.25ml 染色液。混合液现配现用。


4. 细胞毒分析步骤:


( 1 ) 收集细胞,用 1× 分析液(如, 1 %血清或 1 % BSA 培养液)。


( 2 ) 在 96 孔板中分别制备下列样本:


背景对照: 每孔加 200ul 培养液, 3 个复孔。背景值应从其他值中减去。


低对照: 向每孔 200ul 分析液中加 1 - 2×104 细胞, 3 个复孔。


高对照: 向每孔 200ul 含 1 % Triton X-100 的分析液中加 1 - 2×104 细胞, 3 个复孔。


检测样本: 向每孔 200ul 含检测物质的分析液中加 1 - 2×104 细胞, 3 个复孔。


( 3 )在培养箱中( 5 % CO2 ,90% 湿度, 37 ℃ )孵育细胞,孵育时间为检测物质的适当处理时间。


( 4 ) 离心细胞 250g , 10min 。


( 5 ) 每孔小心转移 100ul 上清到相应的优化清洁 96 孔板中。


( 6 ) 每孔加入 100ul 反应混合液,室温孵育 30min 。避光操作。


( 7 ) 用微孔读板仪在 490 - 500nm 检测所有样本的吸光值。参考波长大于 600nm 。


5. 计算细胞毒的百分比:


细胞毒(%)= (检测样本-低对照) / (高对照-低对照) %


(责任编辑:大汉昆仑王)

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