【资源】RNA提取实验方法流程

1、实验目的

提取人体细胞的总RNA和mRNA。

2、本实验所需试剂

1）、CNE-2细胞及培养细胞的一系列条件，

2）、PBS缓冲液， TRIZOL试剂，

3）、DEPC处理过的水、大、中、小Tip及1.5 ml EP管,

4）、新的氯仿、异丙醇和乙醇，

5）、mRNA分离试剂盒：Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN。

6）、新配的电泳缓冲液，专跑RNA的琼脂糖（Agarose）。

3、实验流程

3.1 细胞总RNA的提取

1）、6孔板细胞（CNE-2）汇合度为90-100%时，取出无菌室，去其上清，用PBS洗两次后，每孔加TRIZOL试剂（Gibco公司） 1 ml，摇匀，无菌罩内消化3-5分钟（观察：液体变粘稠，细胞脱壁）。

2）、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5 ml EP管中，加新开的氯仿0.2 ml，轻摇15秒。

3）、室温静置2-3分钟后，12000 rpm，15 min，4℃，离心。然后取上清无色水相（约0.6 ml）到 EP管（DEPC处理过），加0.5 ml新开的异丙醇，室温下静置10分钟。

4）、12000 rpm，10分钟，4℃，离心。观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上清（小心别丢了沉淀），75%乙醇1.0 ml洗涤（用DEPC水新配制）后，7500 rpm，5 min，4℃离心。

5）、去上清，点离，用小Tip吸干液体。气干沉淀5-10分钟， DEPC处理水20-30 ul加入，中枪打匀，55-60℃水浴10分钟溶解总RNA，测OD值。

6）、电泳。

3.2 从总RNA中分离mRNA（Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN）

1）、取上述提取的总RNA若干（少于0.25 mg）到一个新的无RNase 的EP管中，用无RNase的水定容到250 ul

2）、加入Buffer OBB 250 ul, Oligotex Suspension 15 ul。用Tip打匀或用手弹匀。

3）、70℃水浴，3分钟（裂解RNA的二级结构）。

4）、20-30℃条件下，静置10分钟（让Oligotex与mRNA结合）。

5）、高速离心2分钟，小心吸走上清（该上清要保留），留下约50 ul的上清在原管里。

6）、用Buffer OW2 400 ul重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀，然后将这些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上，高速离心1分钟。

7）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加Buffer OW2 400 ul到柱子，高速离心1分钟，丢掉滤过液。

8）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加20-100 ul热的（70℃）Buffer OEB到柱子上，用Tip来回吸打3-4次，高速离心1分钟。

9）、为保证最大的 mRNA产量，可再次重复第8步。

10）、电泳。

4、mRNA的应用

RT-PCR, Northern杂交，cDNA文库构建, mRNA末端快速扩增(RACE)，差异表达(DDRT-PCR)，引物延伸反应(Primer Extension)，体外转录(In Vitro RNA Transcription), RNA标记(RNA labeling)，RNA酶保护试验(RNase and S1 Nuclease Protection Assay)，RNA微注射(RNA Microinjection)