药物/毒物作用后的细胞数量测定
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四甲基偶氮唑盐分析是将四甲基偶氮唑盐还原成甲蜡的颜色,形成紫色,从而来测定活细胞中的酶活性,由于这些试剂能够抑制细胞的活力和生长特性,该方法常用来测量毒性蛋白以及有毒物质。
一、材料和试剂
1. MTT:四甲基偶氮噻唑蓝(Sigma)
2. DPBS缓冲液(Invitrogen)
3. 一般的化学品(Sigma)
二、步骤
1. 96孔板中,每孔种植500~10 000个细胞,每孔体积200 ul。留8个孔不种植细胞,做空白对照。
2. 37℃,5%CO2条件下孵育过夜,使细胞贴壁.
3. 每个孔中加2 ul 研究的药物(溶解于DMSO中)。放置在漩涡振荡器上,150 rpm 震荡5分钟,使得样品完全混入培养液中。
4. 37℃,5%CO2条件下孵育1-5天,使得药物/毒物发挥作用。
5. 每个96孔板准备2 ml 或者更多的MTT溶液(溶于DPBS,浓度为5 mg/ml)。MTT在溶液中不能长期稳定保存,需要现配。
6. 每孔加入20 ul MTT溶液,放置在漩涡振荡器上,150 rpm 震荡5分钟,使得MTT完全混入培养液中。
7. 37℃,5%CO2条件下孵育1~5小时,使得MTT完全被代谢。
8. 倒掉培养基(可以用滤纸吸干96孔板上的残液)
9. 用200 ul DMSO重悬甲臜(MTT的代谢产物)。放置在漩涡振荡器上,150 rpm 震荡5分钟,使得甲臜充分的溶解。
10. 560 nm 处读取光密度值,减去670 nm 的背景光密度值。光密度值的高低与细胞的数量呈正关。