SPA 酶联免疫吸附试验（SPA

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SPA－ELISA技术原理

SPA 能天然地与人及某些哺乳动物的IgG分子上的Fc片段结合，一个分子的SPA可以同2个IgG分子以化学共价键结合(这不是真正的免疫 反应，又称为假免疫反应)，利用这个特性，以SPA代替IgG抗体而应用于ELlSA中。

材料与试剂

1．SPA－HRP结合物,可向有关生物制品厂购买，也可自制，制法如下：

(1) 取5mg HRP(RZ=3.0)溶于1ml新配制的0.3mol/L pH8.1 NaHCO3液中。

(2) 加入0.1ml用无水乙醇配制的1%的1－荧光－2，4二硝基苯，室温(20℃)温和搅拌1h。

(3) 加入1ml0.16mol/L 乙二醇，室温搅拌1h。

(4) 以0.01mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液充分透析。

(5) 加入经0.01mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液平衡的SPA 5mg/ml，于20℃温和搅拌2h~3h。

(6) 加入5mg KBH4，混匀后，4℃放置3h。

(7) 以0.05mol/L pH 7.4 PBS 透析过夜。

(8) 过Sephadex G100柱(100cm×2cm)，以0.5mol/L pH7.4 PBS 液洗脱，流速10ml/h。

(9) 测OD403nm，集SPA－HRP活性部分。

(10) 将高活性组分合并，加入甘油(含30%)置低温保存。也可以采用过碘酸钠法，制法如下：

①5mg HRP溶于1ml新配制的0.3mol/L pH 8.1的NaHCO3液中；

②加入无水乙醇配制1%1－荧光－2,4二硝基苯0.1ml，室温混合1h；

③加入1ml0.6mol/L NalO4(蒸馏水配制)室温中混合30min；

④加入1ml0.6mol/L乙烯乙二醇(蒸馏水配制)，室温缓慢混合1h；

⑤以0.01mol/L pH9.6 NaHCO3缓冲液于4℃透析过夜；

⑥加入透析液平衡的SPA液5mg/ml,室温缓慢混合3h即可。

(11) SPA－HRP活性测定：

①取猪血清IgG10μg/ml 0.1ml包被反应板，4℃过夜，3×3min冲洗；

②加入适量稀释的SPA－HRP溶液0.1ml，置37℃2h，冲洗3×3min；

③加入底物显色，显色的深浅应与SPA－HRP的活性成正比。

2．稀释液 0.05Mol/L pH7.4PBS 液。

3．包被液 pH9.6碳酸盐缓冲液。

4．洗涤液 0.02Mol/L7.4Tris－HCl缓冲液。