基因组非特异性甲基化水平的研究

互联网2010-12-02

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1. 3H―SAM掺入后液闪检测法

（1）将约2 μg 基因组与足量3H标记的SAM，甲基化酶（SssⅠ或HpaⅡ）共同温育，SAM的甲基化基团将被掺人到目的DNA中未甲基化的胞嘧啶上。

（2）以WhatmanDE81滤纸过滤此温育混合物，并以液闪缓冲液淋洗去掉未结合的3H标记的SAM，以液闪检测该滤纸上结合的’H标记的SAM量。

（3）如此值较高，则提示原来的甲基化水平低，反之亦然。

2. 5mC免疫沉淀法（MeCIP）

这种方法是基于能够与5mC发生特异性反应得到单克隆抗体，通过抗体与5mC结合，将甲基化的DNA片段沉淀下来。再通过测量沉淀DNA估计甲基化程度。

3. M．SssI甲基转移酶

M．SssI可以将同位素标记的甲基从S―腺苷甲硫氨酸（SAM）转移到非甲基化的CpG序列上形成5mC，通过测量转移后同位素能量估计总体甲基化水平。

4. 氯乙醛法

DNA经重亚硫酸盐处理，使未甲基化的胞嘧啶全部转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。然后经过银或色谱柱去除DNA链上的嘌呤，再将样品与氯乙醛共同孵育。

这样5mC就转变为带有强荧光的乙烯胞嘧啶，通过观察荧光来计算5mC含量，可以直接测定基因组整体5mC水平。Oakeley（1999）首先描述了这种使用氯乙醛和荧光标记的方法。所用试剂价格低廉且稳定性好，避免了放射性污染。但缺点是费时费力，而且氯乙醛是一种有毒物质。

5. 高压液相色谱法

以盐酸或氢氟酸水解DNA成碱基，经过柱分离和标准品比较，求出5mC/5mC+C的比值，而了解总基因组的总体甲基化情况。该法较准确，但需要精密的仪器，而且不能获得基因的甲基化数据。