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基因组非特异性甲基化水平的研究

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1. 3H―SAM掺入后液闪检测法

(1)将约2 μg 基因组与足量3H标记的SAM,甲基化酶(SssⅠ或HpaⅡ)共同温育,SAM的甲基化基团将被掺人到目的DNA中未甲基化的胞嘧啶上。
(2)以WhatmanDE81滤纸过滤此温育混合物,并以液闪缓冲液淋洗去掉未结合的3H标记的SAM,以液闪检测该滤纸上结合的’H标记的SAM量。
(3)如此值较高,则提示原来的甲基化水平低,反之亦然。

2. 5mC免疫沉淀法(MeCIP)

这种方法是基于能够与5mC发生特异性反应得到单克隆抗体,通过抗体与5mC结合,将甲基化的DNA片段沉淀下来。再通过测量沉淀DNA估计甲基化程度。

3. M.SssI甲基转移酶

M.SssI可以将同位素标记的甲基从S―腺苷甲硫氨酸(SAM)转移到非甲基化的CpG序列上形成5mC,通过测量转移后同位素能量估计总体甲基化水平。

4. 氯乙醛法

DNA经重亚硫酸盐处理,使未甲基化的胞嘧啶全部转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。然后经过银或色谱柱去除DNA链上的嘌呤,再将样品与氯乙醛共同孵育。
这样5mC就转变为带有强荧光的乙烯胞嘧啶,通过观察荧光来计算5mC含量,可以直接测定基因组整体5mC水平。Oakeley(1999)首先描述了这种使用氯乙醛和荧光标记的方法。所用试剂价格低廉且稳定性好,避免了放射性污染。但缺点是费时费力,而且氯乙醛是一种有毒物质。

5. 高压液相色谱法

以盐酸或氢氟酸水解DNA成碱基,经过柱分离和标准品比较,求出5mC/5mC+C的比值,而了解总基因组的总体甲基化情况。该法较准确,但需要精密的仪器,而且不能获得基因的甲基化数据。
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