【原创】6种核酸提取方法附引用文献：动植物RNA（总、m），DNA，质粒

1、植物总RNA的提取

以白菜花药组织为试材, 利用改良Tris-硼酸法提取花药总RNA。提取花药RNA的产量高、质量好、纯度高, 适用于mRNA差异显示及基因表达的Northern印迹等的RNA提取。

分别采取蕾期和盛花期的花蕾和花朵, 迅速将花药剥离, 分装称重后液氮中速冻, - 80℃保存。

1　RNase的灭活　所有用于RNA提取的玻璃器皿均在180℃条件下烘2h以上, 塑料管和枪头用 0. 1%焦碳酸二乙酯(DEPC)溶液在 37℃条件下处理24h后高压灭菌。

2　在改良Gomez法的基础上, 加以改良, 具体操作如下:

1> 0.1g 样品加入10%样品重多聚聚乙烯吡咯烷酮(PVPP), 液氮研磨,

2> 转入离心管后加入 0.5mL 65℃预热的提取缓冲( 150mmol/L Tris , 50mmol/L EDTA , 4%SDS , 硼酸调至pH7. 5) 和 10μL 巯基乙醇, 振荡混匀后加入 20μL蛋白酶K , 37℃提取 1.5h 。

3> 加 50μL 5μL mol /L KAc, 150 μL乙醇, 涡旋。

4> 0. 7mL 氯仿/异戊醇(24∶1)混匀后,8000 r/min 离心20 。

5> 上清加入 0.3mL 苯酚和 0.3 mL氯仿/异戊醇, 10 000r/min ,10min 。

6> 上清中加入0. 3 倍体积12 mol/L LiCl 混匀, - 20℃过夜。

7> 10 000r/min,1min 。沉淀溶于 0.3mL 3 mol/L LiCl 中, 10 000r/min,10min 。

8> 沉淀溶于200μL 重蒸水, 加15μL 5 mol/L KAc, 等体积氯仿/异戊醇抽提, 10 000r/min 5min 。

9> 上清转入两倍体积的乙醇中- 20℃沉淀RNA 。4℃, 10 000r/min 离心20 min。沉淀干燥后溶于20μL DEPC重蒸水中。

史公军 , 侯喜林 , 易金鑫。白菜花药组织总RNA提取方法比较及其分析。西北农业学报，2004, 13 3 : 97～ 99

2、动物总RNA的提取
　
一种用Trizol试剂快速抽提组织总 RNA组织 的方法,此方法提取的总RNA完整无降解。

具体步骤:

1> 取出盛脑组织的离心管置于冰袋上 ,加 TRIzol(50mg组织加 TRIzol0.5ml) 。

2> 用碾磨棒碾成粉末 ,将其转移到1.5ml 离心管中 ,加入100μl 氯仿/异戊醇(24∶1)盖紧盖子 ,剧烈振荡混合 30 秒 ,4 ℃12000 转/分 ,离心10min

3> 将上清液小心转移到无菌 2ml Rase -free 离心管 ,加150 无水乙醇混匀 ,将上述溶液全部转移至套放与2ml 收集管的UNIQ - 10柱中。4 ℃放置2min ,8000 转/分离心 1min。

4> 取出柱子弃去收集管中的废液,将柱子放回收集管中,加入450μl solution RPE,10000 转/分 ,4℃离心30s;弃去收集管中的废液 ,将柱子放回收集管中 ,再加入450μl solution RPE10000转/分室温离心 1min ,弃去收集管中废液 ,将柱子放回收集管 ,在膜中央小心加入 50μl DEPC-水 ,60～80 ℃放置 2min 充分溶解 RNA 4 ℃10000转/分离心 1min。

5> 配制 1～1. 5 %的琼脂糖变性凝胶(1g琼脂糖;10ml 10 ×MOPS;85ml DEPC处理水 ,溶解后加入 5. 4ml 37 %的甲醛 ,18μl 10mg/μl 溴乙锭 。

邓 　莉 ,马春明 ,袁琼兰，等。用TRIzol试剂抽提新生鼠脑组织总RNA。泸州医学院学报，2005，28（6）。

3、动物基因组DNA的提取

是一种简便、快速、有效、微量外周血基因组DNA的提取方法,适应于批量临床标本的处理。

采用 NaI作细胞裂解剂裂解细胞和细胞核 ,用氯仿∶异戊醇(24∶1)直接提取基因组DNA。

具体步骤:

1> 取 EDTA - NaI抗凝血100μl 加入1.5 ml 离心管中 ,加入 1000μl 无菌去离子水 ,轻轻颠倒 5～10次 ,5 000 r/min离心3 min

2> 弃去上清液1000μl ,加入6 mol/L Nal100μl ,混旋 10 s,加入 200 μl 氯仿∶异戊醇(24∶1) ,混旋30 s,10 000 r/min离心3 min

3> 取上清液150μl 于另一离心管中 ,加入 90μl 异丙醇 ,混匀后 ,10 000 r/min 5 min

4> 弃去上清液 ,加入1 000 μl 75 %无水乙醇洗涤沉淀 2 次 ,再加入1 000 μl无水乙

醇洗涤沉淀2 次 ,沉淀置 56 ℃烘干 20 min ,加入 50μl 无菌去离子水或50 l TE溶液,即可用于基因扩增和限制性内切酶酶切分析等分子生物学试验。蛋白酶 K消化法按试剂盒说明书操作。

王龙武 ,石 　柯 ,彭爱红 ,等。一种快速微量外周血基因组DNA的提取方法。中国现代医学杂志,2004,14(2)。

4、植物基因组DNA的提取

用 Sul和 Korkan修正的CTAB方法提取基因组DNA:

1> 称取40-100mg茶叶样品，加人少许PVP，用液氮快速研磨，并转移至新的离心管中。

2> 加人65℃预热的2×CTAB 500μl,然后于65'C水浴3℃ 3-5min。

3> 随后加人等量的氯仿:异戊醇(24:1)混合液，充分混匀，于12000rpm离心5一10min，转移上清液至新的离心管。

4> 再加人等量氯仿:异戊醇(24 : 1)，充分混匀，于12000rpm离心5一10min，转移上清液至新的离心管。

5> 加人两倍体积的无水乙醇，静置 5min，离心直至絮状沉淀出现为止。

6> 去除上清液，加人1-1.5倍体积的70%乙醇清洗。然后空气中晾干，溶于含 RNase的双蒸水或TE buffer，保存于一20'C冰箱备用。

吴 颖,陆建良, 梁月荣,等。“香山早”茶树品系的DNA指纹鉴定研究。茶 叶， 2004,30(2):82-84

5、mRNA的提取

按王升启等报道的方法加以该进

1> 100μl血清中加入等体积的含异硫腈酸胍的裂解液、稀释液及生物素化寡核苷酸探针，混匀后室温放置10min，1200r/min离心10min，上清待用

2 > 取亲核素-磁珠（SA-PMPs,Promega公司产品），100μl放入一新的Eppendorf管中，用磁架将磁珠全部收集在管的一侧，小心倾去上液

3> 用等体积的0.5×SSC溶液悬浮SA-PMPs，磁架捕捉，弃去SSC溶液，洗涤3次，磁珠悬浮在100μl 的0.5×SSC液洗涤磁珠，共3次，最后一次洗后要尽可能全部弃去SSC而不搅动磁珠，即得所需分离的模板。

陈伟红等。磁性分离法快速提取HCV mRNA用于RT-PCR检测。临床肝胆病杂志，1996，12（3）。

6、质粒DNA的提取

以Sambrook的碱裂解法为基础 ，通过控制菌体培养时间，适当调整提取过程中 3种溶液的比倒及作用时问，摸索出 一种适合于提取苏云金芽孢杆菌质粒 DNA的方法．该法与常规碱裂解法相比具有重复性好、质粒 DNA质量高等优点．

1 茵体培养

将 WB50菌株接种在LB平板上，培养 16—18 h后，挑单菌落接种于 2O mL LB液体培
养基中，3O℃振荡培养 10 h左右．

2 质粒DNA的提取

1> 取 1．5 mL培养菌液到离心管中，12 000 r•min-1离心 5 min，弃尽上清，沉淀用 1 mL STE溶液[O．1 mol•L-1 NaC1，10 mmol•L-1Tris-C1(pH 8．O)，1 mmol•L-1 EDTA(pH 8．0)]充分悬 浮，收集菌体．

2> 加 8Oμl预冷的溶液 I(质量分数为 1O% 葡萄糖，50 mmol•L-1 Tris-C1，20 mmol•L-1 EDTA，pH 8．0，高压灭菌)，并加溶菌酶至终浓度为 50 mg•mL-1，RNase至 2O μg•mL-1，充分悬浮菌体，37℃水浴 90min．

3> 加入 720μL 溶液Ⅱ[50 mmol•L-1 Tris-CI(pH 8．O),10 mmol-1EDTA，0．085 mol•L-1 NaOH，质量分数为 1% SDS，现配现用]，反复倒转离心管数次(注意不要剧烈振荡)

4> 室温放置 1-3min,迅速加入 400μL 溶液 Ⅲ(5mol•L-1 KAc120mL，冰乙酸 23mL，无菌水 57mL，配制成 200mL 溶液)，充分混匀，冰浴 120 min．

5> 12 000 r•min-1 离心 5 min，取上清，加入等体积氯仿抽提 1次，再取上清．

6> 加人等体积预冷的异丙醇，轻轻倒转混匀，置于一2O℃放置 30 min．12 OOO r•min -1离心 5-10 min，弃上清，干燥沉淀．用 20 L无菌双蒸水溶解沉淀，一20℃保存备用．

伍赠玲，黄天培，邱君志，等。一种改良的苏云金芽孢杆菌质粒DNA提取方法。福建农林大学学报(自然科学版)，2004，33（2）。