总RNA的变性琼脂糖凝胶检测

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RNA提取

【实验目的】

掌握总RNA变性胶电泳的原理和方法。

【实验原理】

RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0-1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。如需快速检测提取总RNA的质量，可用普通的1% (m/V)琼脂 糖凝胶监察。

判断RNA提取 物的完整性是进行电泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的电泳图谱应可清晰看到28s rRNA、18s rRNA、5s rRNA的三条带，且28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍。

【器材与材料】

1.器材

水平式琼脂糖凝胶电泳系统、电子天平、移液器 、Tip头、电炉、紫外透射检测仪

2. 试剂

(1) 0.1% (V/V) DEPC水

200ml 双蒸去离子水加0.2ml DEPC(焦炭酸二乙酯)，充分搅拌混匀，室温放置过夜，高压灭菌。

(2) 10×电泳缓冲液

吗啉代丙烷磺酸(MOPS) 0.4mol/L(pH 7.0)

NaAc 0.1mol/L

乙二胺四乙酸(EDTA) 10mmol/L

(3) 50mL变性琼脂糖凝胶1% (m/V)

10×电泳缓冲液 　　　 5 ml

琼脂糖 　　　 0.5 g

0.1% (V/V) DEPC水 36.5 ml

加热溶解，稍冷却，加入8.5 ml 37%(V/V)甲醛。

(4) 上样缓冲液：50% (V/V) 甘油，1mmol/L EDTA，0.4% (m/V) 溴酚蓝，0.4% (m/V)二甲苯蓝。

(5) 甲酰胺(去离子)。

3.材料

植物或动物的总RNA溶液。

【操作步骤】

1.电泳槽，制胶用具的清洗：去污剂洗干净(一般浸泡过夜)，水冲洗后用，3% H2O2灌满电泳槽，室温放置10min，用0.1% (V/V) DEPC水冲洗，晾干备用。

2.制胶：称取0.5g琼脂糖粉末，加入放有36.5ml的DEPC水的锥形瓶中，加热使琼脂糖完全溶解。稍冷却后加入5ml的10x电泳缓冲液、8.5ml的甲醛。然后在胶槽中灌制凝胶，插好梳子，水平放置待凝固后使用。

3.加样：在一个洁净的小离心管中混合以下试剂：2μl 10×电泳缓冲液、3.5ml甲醛、10ml甲酰胺、3.5μl RNA样品。混匀，置60℃保温10min，冰上速冷。加入3μl的上样缓冲液混匀，取适量加样于凝胶点样孔内。同时点RNA标准样品。

4.电泳：打开电泳仪，稳压7.5V/cm电泳。

5.电泳结束后通过紫外透视仪观察。

【要点提示】

1. 本实验中必须防止RNase污染，以免RNA降解。所有试剂需用DEPC水配制，用具也用DEPC水冲洗，并灭菌。

2. RNA的非变性琼脂糖凝胶电泳与DNA的操作相同。

【思考题】

如何判断RNA提取物的质量?