水稻功能基因芯片之开发

一、引言

水稻是世界上重要的粮食作物之一，负担近35 亿人口的粮食需求，是全球二分之一人口的主食。根据估计到了公元2050年全球的人口总数预计会大幅成长7.5-10.5亿，而这些新增人口主要集中在以稻米为主食的地区。

根据2009年联合国世界粮农组织(FAO)的报告推估，到了公元2050年全世界的粮食生产，和现在相比，可能要产出额外70%的粮食，来喂饱这些新增的人口，可以想见，稻米的生产在不久的未来，是维持粮食安全的重要指标。

然而近年来因气候异常，几个粮食生产大国如:澳洲、巴西、泰国等，均发生罕见的水患与旱灾，严重打击稻米的生产，间接造成全球粮食供给短少和粮价节节升高等问题[1]。

另外极端气候的频繁发生，也直接冲击稻米的生产，例如:几乎年年都光临台湾的台风，除了破坏山林也带走农民一季的辛劳。此外，根据一些研究的结果显示，温室效性、全球暖化及空气污染等环境因子[2-5]，也在在影响稻米的产量。这些结果也暗示，发展选殖可以适应快速变迁环境的稻种，是迫切且必须的工作[6-7]。

二、传统育种和分子标志辅助育种之比较

传统的育种大概的作法是，选择具有优良性状的亲本经过近缘杂交后，根据外表形态挑选符合预期的子代，再经过自交和回交等方式，将性状固定下来。

因为遗传性状的固定化，需要透过外表形态的评估，因此需要时间和空间，让植株成熟才可以进行评估，评估后再进行下一个育种循环，因此整个育种的工作是非常繁复和耗时的，以传统水稻的育种过程来看，可能需要10-15年的时间才能育出一个新的品系。

而分子标志的补助育种方式，就是利用基因组中的遗传标志如:单核苷酸多形性(SNP：single nucleotide polymorphism)、微卫星标竿(Microsatellites)或短片断重复序列(STRs：short tandem repeats)、小片段的插入和缺失序列(InDel：small insertion or deletion)等标志和遗传性状或基因间的连锁关系，用来确认基因或遗传性状在子代中的传递和固定化的结果[8]。

分子标志辅助育种的优点是，

(1)可以鉴别单一个体的基因型

(2)鉴别的结果不受植物的生长分期或环境因子的影响，因此可以于任何时期，不区分组织进行采样检测

(3)可用于追踪转殖的基因。因此只要确认分子标志和基因性状的紧密连锁关系，就可以检测分子标志来确认基因的存在与否，进而提早选拔挑选带有遗传性状的植株。

因此分子标志的发展和运用，着实促进作物品种的鉴定、基因选殖和基因定位、种子纯度检验和辅助育种等各项工作的准确度和时效性。而日本植物基因体中心(Plant Genomic Center, PGC) 是这方面的先驱，运用分子标志辅助育种的方式，成功育成许多新品系，并将平均育成一个新种的时间缩短成为3年。

三、功能性基因体研究的必要性

由于生物信息学的发展和DNA解序的技术的快速突破，目前有许多的不同类型的整合型数据库被建立，其中包含DNA、EST、cDNA、QTL…等数据库。运用这些数据库的信息也让分子标志辅助育种的工作加快不少。

然而分子辅助育种的进步，虽然让育种的工作加快不少，但是仍然有一些不确定的因素，需要被注意或克服。例如:无法挑选到适合的分子标志，来做为检测的标的;或控制性状表现的基因有数个，但是研究的结果无法明确的挑出那一些是候选基因，因此也无法采用连锁的分子标志做监测，导致检测或育种工作效率不彰。

简而言之，分子标志就像是基因图谱上的地址号码牌，而和分子标志相关连的特定的性状，则是分子标志附近的基因群共同表现造成的结果。这样的理论基础让我们了解，个体性状的表现决定，是一个或一群基因的表现和基因间的互为调控所建立的，因此基因的表现及调控才是决定性状的关键。

然而基因功能性的表现和调控研究，在重视结果论的现代育种过程中，并不太受重视。然而我们认为唯有补强功能性基因体的研究，再结合传统育种的观念和佐以分子辅助育种的技术，所整合的系统生物学的研究成果，才有办法做到持续优化所建立的育成品种，并提供基因转殖的方向和标的基因。

基于以上的理念，我们建构了Rice OneArray®水稻表达谱芯片。

四、适用育种和功能性基因体研究的芯片

华联生物科技所开发的Rice OneArray®水稻表达谱芯片产品，以Rice Genome Annotation Project 最新的 6.1 版与Beijing Genome Institute 2008 年的基因体信息进行探针设计，内容涵括90% 以上的基因批注清楚完整的基因，设计目标着重于参与重要调控反应路径的基因，这些基因的功能主导着包含叶绿体

(chloroplasts)、氧化压力(Oxidative Stress)、稻米质量(grain quality)、氮磷酸盐(nitrogen phosphate)、糖合成(sugar synthesis)、光合作用(Photosynthesis)、植物荷尔蒙(Plant hormone)、花药发育(Anther development)及转录因子(Transcription factors)等生物功能。

结合Michigan State University [9]、GOSlim [10]、KEGG [11]、Gramene [12]与PlnTFDB [13]等数据库与专家意见，从数据库中检索得到的基因数据中，叶绿体有103 个、逆境相关的有3,971个、生物途径相关的有4,106 个、转录因子有2,622 个，合并后总共为9,644 个基因，共产出目标基因群9,719 个。

除了这些的目标基因群外，芯片探针设计亦纳入RGAP 6.1 版上的Gene Ontology 批注信息清楚的基因(GO 基因)，这些基因数目约有18,306 个。

考虑目前种植面积的和产量最大的稻种是籼稻(indica)，但是大部分的研究对象却集中在梗稻(japonica)，加上许多育成种多为籼稻和梗稻的杂交品系，为了打破这种研究上的不平衡，建立一个能够侦测两种品系及杂交种的芯片，成为真正符合效益且可以帮助研究的工具。基于这样的想法，最后在芯片上我们共布放21,179个探针，其中可侦检 japonica 与 indica 两亚系的探针数分别为20,806 与13,683。

五、Rice OneArray®芯片的稳定性和再现性

Rice OneArray®是全球第一个涵盖上述两个品系的水稻基因芯片，为了建立稳定的基因检测方法、测试芯片的再现性和验证结果的稳定度和正确性。我们采集台农67号(Tainung 67, TNG 67)三叶龄稻苗的地上部(shoot)和地下部(root)组织，进行核酸的萃取及芯片的杂交实验。

验证结果显示，以水稻的地上部与地下部RNA 样品进行5 片芯片实验，并计算芯片间的相关性，同一种RNA 样品(地上部或地下部) 的芯片间相关性大于0.985 (表一)，不同部位之RNA 样品芯片相关性则小于0.7 (表一) ，原始资料和正规化后的资料都已上传至NCBI的GEO(Gene Expression Omnibus)数据库，代号为GSE50844。

此外，选取经由芯片实验结果显示过度表现、过度不表现、没有差异表现基因共66个，由实时定量聚合酶连锁反应测量地上部及地下部样本，显示66个基因的芯片和实时定量聚合酶连锁反应结果呈现高度关联性。显示芯片实验具高度专一性、灵敏性和可被验证性，可协助研究人员有效提升水稻作物的筛选与育种。

六、结语

由于植物的多倍体、多样性、及生理调控的复杂度等因素，造成植物功能基因体学研究的困难度。然而功能基因体学的研究进展，对经济作物的品种优化和育种有实质上绝度的帮助，也是无庸置疑的。

以酵母菌这个模式生物的研究为例，因为酵母菌的基因体小，研究开展的早，因此我们对酵母菌的基因功能及基因调控网络也非常的了解。

经由这些知识的累积和应用，MIT(Massachusetts Institute of Technology, MA, USA)的科学家，针对酵母菌吸收木糖(xylose)代谢产生酒精的代谢途径途径的了解，进行基因改造，将数个高效能的代谢相关表现基因转殖到酵母菌的菌株中，用以优化菌株，并经由华联酵母菌芯片进行研究和监控，以木糖取代葡萄糖用以减少原料成本，并增加酒精的转换率[14]。

由这个例子的成功展示，让我们发想或许有天我们也可以经由对水稻功能基因的全盘了解，进而达到优化水稻品种。

基因芯片为一个可提供大量且快速进行大规模转录体研究的工具，华联水稻芯片自推出以来，已经累积超过1000笔芯片数据，希望不久的将来能透过芯片数据的迅速累积、分析工具及数据库的建立，提供植物生理学家及育种专家一个可靠的辅助平台，加速研究的进程。

(本篇文章由华联生技陈嘉兴博士撰写，投稿于台湾经济研究院生物科技产业研究中心今年出版之「农业基因体科技应用发展现况与趋势专题报告」)

七、参考文献

1. Butler, C.D., Food security in the Asia-Pacific: climate change, phosphorus, ozone and other environmental challenges. Asia Pac J Clin Nutr, 2009. 18(4): p. 590-597.
2. Auffhammer, M., V. Ramanathan, and J.R. Vincent, Integrated model shows that atmospheric brown clouds and greenhouse gases have reduced rice harvests in India. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103(52): p. 19668-72.
3. Cramer, W., Air pollution and climate change both reduce Indian rice harvests. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103(52): p. 19609-10.
4. Peng, S., et al., Rice yields decline with higher night temperature from global warming. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(27): p. 9971-5.
5. Tao, F., et al., Climate changes and trends in phenology and yields of field crops in China, 1981–2000. Agricultural and Forest Meteorology, 2006. 138(1): p. 82-92.
6. Luo, L., Breeding for water-saving and drought-resistance rice (WDR) in China. Journal of experimental botany, 2010. 61(13): p. 3509-3517.
7. Redman, R.S., et al., Increased fitness of rice plants to abiotic stress via habitat adapted symbiosis: a strategy for mitigating impacts of climate change. PLoS One, 2011. 6(7): p. e14823.
8. Collard, B.C.Y., et al., Rice molecular breeding laboratories in the genomics era: current status and future considerations. International journal of plant genomics, 2008. 2008.
9. Kattge, J., et al., TRY–a global database of plant traits. Global Change Biology, 2011. 17(9): p. 2905-2935.
10. Camon, E., et al., The Gene Ontology annotation (GOA) database: sharing knowledge in Uniprot with Gene Ontology. Nucleic acids research, 2004. 32(suppl 1): p. D262-D266.
11. Kanehisa, M. and S. Goto, KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic acids research, 2000. 28(1): p. 27-30.
12. Ware, D., et al., Gramene: a resource for comparative grass genomics. Nucleic Acids Research, 2002. 30(1): p. 103-105.
13. Pérez-Rodríguez, P., et al., PlnTFDB: updated content and new features of the plant transcription factor database. Nucleic acids research, 2010. 38(suppl 1): p. D822-D827.
14. Zhou, H., et al., Xylose isomerase overexpression along with engineering of the pentose phosphate pathway and evolutionary engineering enable rapid xylose utilization and ethanol production by Saccharomyces cerevisiae. Metab Eng, 2012. 14(6): p. 611-22.