【原创】肺组织RNA提取心得

小硕，刚进实验室不久，自己想的课题，外加老婆的建议和帮助下，RT-PCR外加琼脂糖电泳顺利跑了下来，前两天标本的目的基因及内参都P出来了，内心小高兴一把。图未上，等拷回来补传上来。虽然还有小毛病，但是起码还是有点结果了。

说说肺组织提RNA，是癌旁5CM以及肿瘤组织切下来放液氮中冷冻，后转-80度冷藏。标本是守在手术室里面，一切下来就取的，不存在RNA降解问题。

前期的标本是直接放进2ml离心管里面的，后来在从2ml离心管取出组织的时候才发现组织在冷冻的情况下与离心管粘连严重，难以分离（组织块太大），所以在提取组织的时候，别贪多，取少量就可以，建议将组织剪成几颗黄豆大小，再装进离心管中。

最早的一个标本，是个肿瘤组织，2011-11月的组织，用的是超声粉碎细胞仪，取黄豆大小装入新的2ml离心管中，泡在1m ltrizol中，离心管置入冰盒中，因为超声粉碎细胞仪工作过程会产热，加快RNA的降解。

后续的步骤大同小异，后来用nanodrop测A260/A280在1.83，还能够忍受。后来溶解RNA的时候，直接加了200ul的DEPC水，浓度太低，没进行RT。

然后第2次提，还是用正常组织，在研钵下研磨的，研钵没经过DEPC水处理，直接trizol中研磨，肺正常组织在常温下比较难研磨，后来提出来纯度低，才1.45-1.52左右。考虑存放时间，组织RNA降解可能，但是后来想想不对，之前提的组织可以到1.83，应该不存在组织在低温下降解可能。估计是在研磨过程中RNA降解。

第3次，向实验室里面的同学讨来液氮，进行液氮研磨，研钵还是未经DEPC水处理，直接在液氮中研磨肺正常组织，过程中可以将肺正常组织研磨成粉末状，但是研磨成粉末在加trizol步骤的时候，因为温度太低，trizol直接被冰冻成冻土状，在等trizol融化的过程中，有组织RNA降解可能。

两个正常组织标本，分成4份提取，后来测出来的RNA，其中一份纯度为1.74，浓度还行，后来做了RT以及PCR，跑琼脂糖，内参及目的基因都有表达。证实了两点：1、组织经液氮运输后转入-80度冰箱，RNA的降解可以忍受。2、研钵可以不经DEPC水处理即可用于研磨提取肺组织RNA。

今天换另外一种方法粉碎组织，用的是机械组织粉碎机，刀片的那种。不过这次的组织是从标本中分离下来后，放在装有trizol的2ml离心管中，液氮罐转运，转入-80度低温冰箱，提取前置于冰上融化trizol，等trizol融化后上组织粉碎机，组织比较大块，但是还是能粉碎的。

后续正常提取步骤，鉴定纯度分别为1.91,2.01,1.89,1.93。下午6点多完成的RT，明天等着PCR及跑胶。

好了，暂时先写到这里，给大家提供我提RNA的经验供大家参考。