TaqMan Pri-miRNA Assays：检测MicroRNA表达的起源

【摘要】 初级microRNA（pri-miRNA）是长链非编码RNA转录本，至少有一个（更常见的是多个）约65 nt茎环结构的前体microRNA（pre-miRNA），这些前体microRNA中含有成熟的microRNA（miRNA）序列。TaqMan Pri-miRNA Assays让这种新“基因”种类的转录能够轻松方便地定量，其灵敏度和特异性足够分辨多个miRNA位点。

初级microRNA（pri-miRNA）是长链非编码RNA转录本，至少有一个（更常见的是多个）约65 nt茎环结构的前体microRNA（pre-miRNA），这些前体microRNA中含有成熟的microRNA（miRNA）序列（图1）。pri-miRNA转录本的切割最终导致具生物活性的成熟miRNA的释放，最终实现对信使RNA靶点的降解，或更常见的是翻译阻遏。
       
                                                         图1. MicroRNA的生物起源

分析设计与选择

所有的TaqMan® Pri-miRNA Assays都是利用Applied Biosystems最新的TaqMan® 分析设计算法来设计的，此算法带来了金标准的分析性能和数据质量。由于pri-miRNA转录本还未详尽地定位，所以分析在设计时很接近Sanger miRBase数据库中每个茎环序列，确保对含有目的成熟miRNA的初级转录本进行准确测定。此方法的额外优势是，每个公开的茎环都有一个配对的TaqMan® Pri-miRNA Assay和TaqMan® MicroRNA Assay，让miRNA成熟途径中任一阶段的RNA序列都能独立地定量。

设计过程一开始将茎环序列定位到最新版本的人、小鼠和大鼠基因组中。接下来，在茎环结构任一侧紧挨着的500个碱基对的区域都作为设计对象，并选择出得分最高的分析（图2）。不定位在单个染色体坐标的分析会严重扣分，帮助确保最终精选的分析测定了单个基因组位置的转录。

                              
                                        图2. TaqMan® Pri-miRNA Assays的设计方法

来自Sanger miRBase的茎环序列与基因组比对。在茎环任一侧延伸500个碱基对的侧翼序列作为分析设计的对象。

为了方便起见，TaqMan® Pri-miRNA Assays和TaqMan® MicroRNA Assays都能用相同的在线界面来平行识别、选择和购买。利用新的比对定位浏览器可简化对两种分析类型之间的空间关系的了解（图3）。
                
                
                                                                   图3. 比对定位浏览器

TaqMan® Pri-miRNA Assays和TaqMan® MicroRNA Assays的位置共同显示在茎环序列（绿色空心框）和成熟miRNA序列（绿色实心框）的背景下，让每个分析在初级转录本上的空间关系能很容易地理解。更多的分析细节显示在右侧。灰色区域代表了作为分析设计对象的区域。

应用

TaqMan® Pri-miRNA Assays让这种新“基因”种类的转录能够轻松方便地定量，其灵敏度和特异性足够分辨多个miRNA位点。这对于解决下列miRNA表达和功能性方面的关键问题非常理想：

• miRNA“基因”转录的调控
       11%的成熟miRNA序列产生自多个基因组位点的转录。也就是说，成熟miRNA序列来自多个茎环，即多个pri-miRNA序列。通过利用特异针对各个pri-miRNA转录本的TaqMan® Pri-miRNA Assays，能将转录改变与目的miRNA在成熟水平所检测到的变化直接关联。

• miRNA生物发生的调控
        最近的观察数据表明，成熟途径的多个步骤都受到调控（Heo，2008；Viswanathan，2008）。在阐明这些调控事件何时是成熟miRNA水平所检测到变化的成因时，关键要排除初级转录本在基因水平的的转录变化。TaqMan® Pri-miRNA Assays是定量目前成熟途径中初级转录本集合的理想工具，与特异针对成熟miRNA的TaqMan® MicroRNA Assays共同使用，能够识别并鉴定出在成熟途径水平上所发生的调控事件。

• Pri-miRNA转录本的定位
        MicroRNA基因座一般是多顺反子的，其中同一个初级转录本中多个miRNA序列聚集成簇。然而，许多pri-miRNA转录本的一级结构还未充分鉴定。利用独特的设计方法，多个TaqMan® Pri-miRNA Assays之间的关联度能够成为一种独特快速的方法，来定位miRNA茎环簇。

分析性能

TaqMan® Pri-miRNA Assays带来了Applied Biosystem® TaqMan®分析所闻名的高灵敏度、极佳特异性和宽的线性动态范围。由于分析灵敏度高，TaqMan® Pri-miRNA Assays只需要极少的样品投入：低至1 ng的总RNA已足够定量中等至高表达miRNA位点的表达。

与miRNA研究领域的顶尖研究人员合作，我们展示了分析在分辨包含密切相关的miRNA茎环序列的不同基因座上的能力（图4）。这对于它们在研究基因调控这个重要方面的应用很关键。
             
        
                                                  图4. TaqMan® Pri-miRNA Assays显示出高特异性

利用含有pri-miRNA茎环mir-26a-1或mir-26a-2（它们共享同一个成熟hsa-miR-26a序列）的质粒，pri-mir-26a-2 TaqMan® Pri-miRNA Assay只检测hsa-mir-26a-2质粒的特异性得到证实。（由韩国首尔国立大学的Young-Kook-Kim 和Narry Kim提供。）

流程

TaqMan® Pri-miRNA Assays采用了与所有Applied Biosystems® TaqMan® Gene Expression Assays相同的简单方便流程。无论是两步法实时定量PCR（RT-qPCR）步骤的可靠性，一步法RT-qPCR步骤的便利性，还是快速循环的速度，Applied Biosystems都提供了经过验证的试剂盒，支持这些不同的分析流程。在定量前必须确保样品是不含DNA的，这一点很重要，因此分析经过了额外的验证，利用Ambion® TURBO DNA-free™ Kit来进行样品的预先纯化。

介于TaqMan® Gene Expression Assays和TaqMan® Pri-miRNA Assays共享相同的设计方法和实验流程，同样多种选择的TaqMan® Gene Expression Assays的内源对照分析也推荐与TaqMan® Pri-miRNA Assays共同使用。

• 高度特异——单个基因组位点的定量microRNA转录
• 快速、简单，可扩展——两步法RT-qPCR提供了高质量的结果
• 新视角——在基因水平测定microRNA的表达