microRNA 研究实验导航—定量分析

近两年microRNA的研究受到越来越多科学家的关注，大量的实验结果揭示了microRNA在胚胎发育、癌症等方面起到非常重要的调控作用，据推测microRNA可能调控至少30%的基因的表达情况。

如果您也想开展microRNA的研究，该如何下手了？首先你需要知道在你感兴趣的研究领域里到底有哪些miRNA是活跃分子，幸运的话通过阅读发表的文章就能锁定一些miRNA分子，否则需要做一个miRNA表达谱芯片分析来初筛出有研究价值的那些miRNA。表达谱芯片的原理简单的说就是把待测样品中的miRNA与芯片上互补的探针序列杂交，通常待测样品中的miRNA 3'端会标记上荧光基团，杂交洗涤后可扫描荧光强度，大量数据处理后便可筛选出有显著表达差异的miRNA，这些“脱颖而出”的群体就是你要瞄准的研究对象了。

接下来，需要精确检测这些miRNA在你研究的细胞或是组织样品中的表达水平了，你可以收集大量的标本筛出biomarker，或是采用多种条件刺激样品来阐述信号通路。由于Northern blotting涉及到的步骤较多、耗时长、难以精确定量，这里介绍更快速简单并且能精确定量的检测miRNA的方法 — real-time PCR，针对miRNA的real-time PCR与常规的real-time 有所不同。
目前有的公司提供的是探针法试剂，有的是SYBR Green法试剂，因探针法试剂成本较高，丁香通在此挑选出SYBR Green法的代表作 — QIAGEN公司的完整的一套miRNA定量试剂miScrip system来介绍，这次比起其他进口品牌同系列的产品，QIAGEN价格倒是不贵。

第一步是miRNA的提取，核酸提取无疑是QIAGEN公司的绝活，对于miRNA这样的小分子，QIAGEN自有妙招，即便是FFPE组织标本，采用经典的硅胶膜选择吸附离心柱，配上优化好的各种buffer，可以快速纯化出所有大于18个核苷酸的RNA。另外还提供Protocol用于单独富集<200nt的小RNA，在芯片分析时也许能降低背景信号，不过在real-time PCR实验中倒是用不着。

第二步是逆转录反应，这里就有别于普通的针对mRNA的RT反应了，因为真核生物mRNA都是有poly-A尾巴的，这样Oligo-dT逆转录引物就很容易结合到mRNA上来合成cDNA了。miRNA就缺了poly-A尾巴，于是QIAGEN的对策就是在RT kit里加了poly(A) polymerase先给那些无poly-A尾巴的RNA分子加上一串A尾巴，然后用带有一段通用序列（universal tag）的Oligo-dT及RT酶来合成cDNA。这样设计的一个好处就是一次RT反应合成了所有miRNA分子以及其他小RNA、mRNA对应的cDNA，接下来想用来检测什么都可以，细细算来省了不少特异引物和多次RT反应的钱呢！整个RT反应操作也是非常简单，加入预先混好的酶，37℃孵育60min，95℃孵育5min即完成cDNA合成。

最后一步就是取出一点cDNA为扩增模板，加入正反引物和real-time PCR 试剂盒中的酶预混液及buffer就可以开始热循环了。正反引物中有一条是特异性的miRNA引物，针对人、小鼠、大鼠、病毒95%以上miRNA的特异性引物QIAGEN已经设计好了，免去你自己设计优化的烦恼，可以通过他们的网站www.qiagen.com/GeneGlobe查询定购；另一条引物是通用的引物，包含在real-time PCR试剂盒里面。如果你还想检测其他小RNA或是mRNA的表达水平，只需加入相应的扩增引物就行，可谓一款试剂多种用途。

为了方便刚刚开始进行miRNA研究的工作者，QIAGEN特别提供miRNA定量检测启动装，一个试剂盒里面包含逆转录、内参引、阳性对照、real-time PCR扩增所有的组分，您很快就可以学会定量分析microRNA的表达量了。

实验进行到这里，只是在进行miRNA量变的研究，更进一步可以升华到某些特定miRNA功能的探索，采用类似RNAi沉默技术，miRNA同样可以被沉默或者高表达，QIAGEN提供miRNA Inhibitors和miRNA Synthesis 产品来分别完成，详细的实验方案请见下回分解。

microRNA 研究实验导航—功能分析

找到差异表达的miRNA后，更进一步的就可以探究这些差异表达跟表型差异是如何关联起来的，即这些差异表达的miRNA到底是调节了哪些蛋白质的表达，这是个非常复杂的网络，一种miRNA通常调控多种蛋白质的表达，一种蛋白质也可能受多种miRNA调节。
QIAGEN提供3种方式去研究miRNA的靶标：

一种是过量表达miRNA，采用直接转染miRNA模拟物（mimic，化学合成的双链RNA分子）到细胞中，通常过量的miRNA引起靶蛋白表达量显著降低，这个可以通过Western blot来检测。很重要的一点是选择哪些蛋白去检测呢？生物信息学可以帮助预测miRNA的靶标，如TargetScan、PicTar等，（链接到http://www1.qiagen.com/Products/ByApplication/miRNA/?WT.svl=m）也可以根据现有文献作一些推测。

另两种是相反的方式，一种是采用直接转染miRNA抑制剂（inhibitor，化学合成的单链RNA分子）到细胞中，inhibitor会抑制相应的内生miRNA的作用，其机制目前尚不完全明确，可能是结合到成熟miRNA上阻止其发挥作用，也可能是阻止了miRNA前体的加工或其从核内转运到胞浆，最终引起靶蛋白表达量上升；另一种是转染了Target Protetor，单链RNA分子，序列和inhibitor不同，Target Protetor会直接结合到靶mRNA序列上阻挡内生miRNA与靶序列结合，这样靶蛋白的表达量就会上升。这两种方式的不同就是inhibitor会引起所有靶蛋白表达上升，而Target Protetor只会引起某个特定的靶蛋白表达上升。

由于某些内生蛋白的表达量很低，通过western blot很难检测到其表达量是否发生变化，这时可以采取另外一种办法，将靶mRNA上的miRNA结合位点构建到一个报告基因检测系统中，如荧光素酶报告基因检测系统，通过观察报告基因的表达就很容易看出预测的靶标是否正确。

详细的实验指南可参见QIAGEN网站 — miRNA功能分析资源中心。请点击此处