SNPs检测方法之比较

一、定义

单核苷酸多态性( single nucleotide olymorphisms ,SNPs)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性。

二、SNPs的研究意义

遗传标记

具有已知性、可遗传性、可检测性，用于疾病基因的定位、克隆和鉴定。

基因多态与疾病相关性

研究SNPs 本身对机体的影响，尤其是疾病的易感性、个性化医疗。

三、SNPs检测方法的分类

1、测序方法：常规测序， Pyrosequencing（焦磷酸测序），微测序(SNaPshot)

2、基于杂交的方法：Taqman 探针法，Microarray 芯片法，

3、引物延伸：MALDI-Tof，dHPLC（变性高效液相色谱技术）

4、以构象为基础的方法：RFLP，SSCP，DGGE

5、溶解曲线：HRM(高分辨率溶解曲线分析技术)

四、各方法概述与比较

测序方法

1、测序方法------ 一般测序和焦磷酸测序

步骤：

序列比对-- 引物设计-- DNA 提取-- PCR - 割胶纯化-- 直接测序或装克隆测序。

优点：

SNP 分析金标准，能发现已知SNP，也能发现未知SNP。

缺点：

每个样本的每个位点均需要经PCR 扩增，跑胶，然后切胶纯化，再测序。步骤多而分散，成本较高，工作量大，周期长，价格昂贵，不适合大样本多位点检测。

2、测序方法------微测序方法（SNaPshot）

微测序流程：

1）.设计PCR 扩增含SNPs 位点的一段DNA

2）.对PCR 产物进行纯化（去除引物和dNTP)

3）.引物延伸

4）.延伸产物检测（放射性同位素标记法、发光检测法、凝胶为基础的荧光检测法、质谱分析法、变性高压液相色谱法等）

优势：

类似普通测序，但10 个位点PCR 产物同时引物延伸，通量增加。

劣势：

前处理等同普通测序：每个样品的每个位通过点都需要PCR预先扩增，跑胶，割胶，DNA 纯化。不同是10 个位点可以同时测序，提高了测序效率，但对延伸引物要求极高，如每个引物有4-6 个碱基差异，不能有互补区段，还要相同条件延伸，除厂家已经验证的少数位点外，很难自己设计针对新位点的检测。多个分散步骤，费钱费时，易出错。

3、测序方法------费用成本组成：

♦ 基因组DNA提取费用

♦ 引物设计及合成费用

♦ PCR扩增费用

♦ PCR产物纯化费用

♦ 测序费用

基于杂交的方法

1、杂交方法----Taqman探针技术

步骤：

序列比对-- 引物和特异探针设计-- DNA 提取-- PCR -- 结果分析。

优点：

准确度高，适合样本多、位点数量少的检测。

缺点：

价格昂贵（探针合成费用高），仅检测已知SNP 位点，不能同时发现未知SNP。

Taqman费用成本组成

♦  DNA提取费用

♦ 引物合成费用

♦ 荧光探针合成费（昂贵）

♦ PCR扩增费用

2）杂交方法---Microarray芯片法

优点：

高通量，适用于全基因组SNP 扫描，适用于少样本、多（全）SNP 位点筛查；

缺点:

准确度偏低，需要第二种方法验证；

只能识别已知SNP 位点；

不适宜多样本、少数SNP 位点的检测；

价格昂贵。

引物延伸

1、引物延伸----- MALDI-Tof

质谱分析操作流程:

① 人类基因组DNA 的制备；

② PCR；

③ PCR 产物的纯化；

④ 等位基因特异性引物延伸反应；

⑤ 等位基因特异性引物延伸反应产物的纯化；

⑥ 样品的制备；

⑦ 检测及基因分析。

优点：

快捷、所需样标本量极少。

缺点：

前处理工艺复杂，包括一次PCR、一次特异引物延伸、两次纯化。要求高，必须去除样品中的干扰性离子（钠，钾），方能

获得真实信息的MALDI-TOF 波谱。

适宜于已经优化的特定SNP 检测，不适宜该服务商未做过的新SNP 检测。

MALDI-Tof费用及网上报价评价

2、引物延伸---dHPLC

流程：DNA 提取- PCR 扩增-变性后缓慢复性-检测以及分析

优点：快速、低成本、高灵敏

缺点：

可判断有否突变，不能确定SNP 的位置和类型，需用标准样品或结合测序验证。

只能检测杂合突变是DHPLC 的主要不足之处。

在SNP 筛查的检测通量、灵敏度与成本等方面与最新的

HRM 技术相比都明显落后。

dHPLC检测的成本构成：

♦ DNA提取费用

♦ 引物合成费用

♦ PCR扩增费用

♦ dHPLC检测费用

溶解曲线

1、溶解曲线----HRM技术

步骤：

序列比对---引物设计--- DNA 提取---荧光染料（EvaGreen 或LC green）PCR ---结果分析。

优点：

高通量、简单、快速、省钱、高灵敏度；

闭管检测，避免污染造成的假阳性；

可检测已知和未知SNP；<400bp扩增产物内SNP，灵敏度和精确度100%。

与传统的扩增后需借助额外的仪器进行凝胶电泳的非均一性的突变检测（例如dHPLC）相比，HRM提供了更高特异性和灵敏度的检测，同时允许了更高的样本检测通量，大大降低了成本。

缺点：

如LightCyclerTM 480 PCR 仪，或LightScanner 等少量仪器可以使用。专业技术要求高，需要专业人员操作。

HRM检测成本构成：

♦ DNA提取费用；

♦ PCR反应费用；

♦ 荧光染料Evagreen费用（较低）。

HRM检测SNP特点：

检测成本最低；

唯一真正实现高通量的SNP检测方法，人工成本最低；

唯一闭管操作，步骤最少，可靠性极高