高通量测序技术在肠道菌群多样性研究中的应用

在人体肠道中生活着数以万亿的共生菌群，它们的种类繁多，可达上千种，数量也很惊人，是人体细胞总量的10倍以上，迄今为止，仍有80%以上的微生物不为人知。这些肠道微生物和人体存在着互利共生的关系，对于维持人类的健康发挥着重要的作用。它们在肠道中保持着一种动态的平衡，能够合成维生素、帮助人体从食物中吸收营养、维持肠道免疫系统功能、抵挡有害微生物的侵害，但是当这种平衡因某些因素被打破致使肠道菌群发生紊乱时，人体就可能患上诸如肥胖症、糖尿病、肠炎甚至癌症等疾病。为了加深对人类疾病发生原因、药物作用机理的理解，继人类基因组计划之后，科学家们又启动了人类元基因组计划，这使肠道菌群的研究迎来了一个新的浪潮。

在以往的肠道微生物群落多样性研究中，人们主要采用DGGE等分子生物学方法及生物芯片对肠道菌群进行研究，但是这些方法都存在一定的缺陷。如DGGE只能检测到环境样品中十几种优势菌，但是对痕量微生物却束手无策；电泳条带中包含不只一种16S rDNA序列，要获悉具体的菌种信息，还需进行克隆、测序，实验操作繁琐；此外，采用这种方法不能反映微生物的丰度情况。而生物芯片通过固定在芯片上的探针来获得微生物多样性的信息，“只能验证已知，却无法探索未知”，通过信号强弱判断微生物的丰度也不是非常的准确。新一代高通量测序技术自2005年问世以来，以其数字化信号、高数据通量、高测序深度、高准确率等特点，已被广泛的应用于肠道菌群的研究中，发表的论文达60多篇，其中不乏发表于Nature、PNAS、Genome Res、Gut、Gastroenterology等国际顶尖杂志上的文章。Roche 454测序平台由于读长较长，达300～500bp，能跨越16S rDNA序列一个或几个可变区，是微生物多样性研究的最佳平台，使用该平台发表的关于肠道菌群的论文达50多篇。美吉生物拥有Roche 454测序平台，在肠道微生物群落多样性研究方面积累了大量的成功案例。

 美吉生物研究人员通过大量相关文献的阅读，发现高通量测序技术在肠道菌群多样性研究中的应用主要聚焦于以下几个方面：① 饮食、能量摄取、肥胖与肠道菌群之间的关系；② 肠道菌群与疾病发生之间的关联；③ 抗生素治疗对肠道菌群的影响；④ 不同个体肠道微生物群落结构及其受其他外界因素（压力、致病菌感染、手术）的影响等。下文对其中的一些文章进行了介绍：

一、饮食、能量摄取、肥胖与肠道菌群之间的关系

1. A core gut microbiome in obese and lean twins--2009《Nature》

Turnbaugh PJ等人对胖瘦不同的同卵双胞胎（31对）、异卵双胞胎（23对）及其母亲（46个）共154个个体的肠道微生物进行了研究。采用454高通量测序平台测定了这些个体中微生物16S rRNA基因的V2和V6区，并选取了18个个体，测定了其肠道微生物群落的DNA。结果表明肥胖与肠道门级微生物的变化相关，胖人与瘦人相比，微生物多样性明显降低，拟杆菌门（Bacteroidetes）所占比例较低而放线菌门（Actinobacteria）所占比例较高。Shotgun reads与多个数据进行比对，发现不同个体中含有大量共有的微生物基因，在基因水平上可将它们定义为“核心微生物组”，而个体中的微生物与核心微生物组的偏离，则与各种不同的生理状态相关（如胖瘦）。

2. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa--2010《PNAS》

为了研究饮食对肠道微生物群落多样性的影响，Filippo CD等人采用454高通量测序技术比较了15个健康欧洲孩子（EU）及14个健康非洲农村孩子（BF）肠道微生物群落的组成。EU的饮食具有典型的西方特色，而BF的食物则能代表传统的非洲乡下的饮食构成。研究人员通过PCR扩增29个粪便样品的16S rRNA基因V5-V6区DNA片段并进行高通量测序，共获得了438,219条高质量的reads。RDP数据库比对结果显示94.2%的reads属于放线菌门（Actinobacteria），拟杆菌门（Bacteroidetes），壁厚菌门（Firmicutes）和变形杆菌门（Proteobacteria），然而它们在EU和BF中的比例具有显著差异。BF肠道中拟杆菌占大部分，而壁厚菌所占比例较低。有趣的是，含有大量纤维素和木聚糖水解基因的Prevotella和Xylanibacter菌株只存在于BF中，并且所占比例较高。

二、肠道菌群与疾病发生之间的关联

1. Gut Microbiota in Human Adults with Type 2 Diabetes Differs from Non-Diabetic Adults--2010《PLoS One》

以往文献报道肠道菌群与人类代谢疾病之间存在着某种关联，为了研究糖尿病与肠道微生物的关系，Nadja Larsen等人以18个II型糖尿病男性患者及18个正常男性为研究对象，采用454高通量测序技术对其粪便中微生物16S rRNA基因的V4区进行了测序。序列分析结果发现这些序列分属于五个门的微生物，包括壁厚菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形杆菌门（phyla Proteobacteria）, 放线菌门（phyla Actinobacteria）和疣微菌门（phyla Verrumicrobia），其中壁厚菌门和拟杆菌门所占比例高达90%以上。糖尿病患者的肠道菌群中壁厚菌门和梭菌纲（Clostridia）的含量明显低于正常人。另外，拟杆菌门/壁厚菌门以及Bacteroidetes-Prevotella/ C. coccoides- E. rectale的比例与血糖浓度成正相关，但是与身体指数却不相关。β变形杆菌（Betaproteobacteria）在糖尿病患者中也大量富集现象，并且这类细菌与血糖浓度也成正相关。以上结果揭示人类II型糖尿病的病因与肠道微生物群落组成变化有联系。

2. Towards the human colorectal cancer microbiome--2011《PLoS One》

Marchesi JR等人采用454高通量测序技术比较了结肠肿瘤和正常结肠粘膜微生物组成的区别。测序样品来自6个接受了切除术的结肠癌早期患者，选择的测序区域为16S rRNA基因的V1-V3区。将获得的测序序列与Sliva和RPD数据库进行比对分析，发现两个不同位点的微生物定植模式具有惊人的差异。虽然结肠癌患者个体之间存在一定的差异，肠道肿瘤组织总是为Coriobacteria和一些有益菌形成微生态环境，而潜在的致病性肠杆菌（Enterobacteria）在这些部位却不具有代表性。研究还发现结肠癌相关的生理和代谢改变招来了觅食肿瘤的共生细菌，它们具有很强的竞争优势，可能取代了致病菌而牵涉到结肠癌的病因中。

三、抗生素治疗对肠道菌群的影响

1. Vancomycin-resistant Enterococcus domination of intestinal microbiota is enabled by antibiotic treatment in mice and precedes bloodstream invasion in humans--2010《J Clin Invest》

耐万古霉素肠球菌（VRE）等高度耐药性细菌感染引起的血液病是一个日益严重的临床难题，而准确诊断高危病人是否患有细菌性败血症仍极富挑战。最近的研究表明抗生素能够改变肠道微生物的多样性。为了对抗生素的影响情况进行分析，Carles Ubeda等人以感染了VRE的小鼠为研究材料，采用454高通量测序技术对其回肠样品的16S rRNA基因的V2区进行了测序。研究结果显示对小鼠进行抗生素治疗会导致外源VRE几乎完全取代小肠和大肠的正常菌群。在临床上，研究人员也发现接受造血干细胞移植的患者在血液感染之前，使用抗生素治疗会导致VRE“称霸”肠道菌群。抗生素能扰乱正常的共生肠道菌群，并为医院中的感染性病菌“统治”肠道菌群提供机会。因此，通过高通量DNA测序分析肠道微生物多样性为诊断高危病人是否患有细菌性败血症提供了有效的手段。

2. The Pervasive Effects of an Antibiotic on the Human Gut Microbiota, as Revealed by Deep 16S rRNA Sequencing--2008《PLoS Biology》

来自斯坦福大学的研究人员采用454高通量测序技术探索了抗生素对人类肠道微生物群落组成的影响。他们测定了3个人在服用环丙沙星前后肠道微生物16S rRNA基因的V6和V3区的序列。将获得的序列与Silva和RPD数据进行比对，共鉴定得到了3,300～5,700个分类单元。研究发现服用抗生素环丙沙星会降低人体肠道微生物的丰富度、多样性及均匀度，受影响的细菌类群约达三分之一，但是这种影响程度存在显著的个体差异。另外，研究人员还指出，4个星期后肠道菌群基本已经恢复到用药前的状态，但有些细菌在6个月后仍没有恢复。

四、不同个体肠道微生物群落结构及其受外界因素（压力、致病菌感染、手术）的影响

1. Composition, variability, and temporal stability of the intestinal microbiota of the elderly--2011《PNAS》

人体肠道微生物群落结构在婴幼儿、成年人和老年人这三类人群中具有显著的差异，这表明随着年龄的增长，肠道菌群也历经了巨大的变化。Claesson MJ等人收集了161位65岁以上老人及9位成年人肠道菌群的样品，采用454焦磷酸测序技术测定了16S rRNA基因的V4区序列，每个个体产出超过40,000条reads。研究发现68%的个体肠道中最优势菌群为拟杆菌门（Bacteroidetes），平均比例约为57%，壁厚菌门（Firmicutes）所占比例约为40%。但是和一些疾病或健康相关的菌群在不同个体中所占比例差别极大，包括变形杆菌门（Proteobacteria）,放线菌门（Actinobacteria）和Faecalibacteria。老年人的核心微生物组与年青人也有鲜明差异，前者拟杆菌属所占比例更大，梭菌属在两者之间具有不同的丰度模式。分析26组time-0和time-3 month粪便样品，发现85%的个体在这两个时间的微生物组成极其相近，这表明老年人的肠道菌群呈现出时间稳定性。

2、Stressor exposure disrupts commensal microbial populations in the intestines and leads to increased colonization by Citrobacter rodentium--2010《IAI》

Bailey等人以小鼠为研究对象，探索了压力对肠道微生物群落多样性及肠道病原菌易感性的影响。采用454高通量测序技术测定了小鼠肠道微生物16S rRNA基因的V4区，将获得的数据与RPD进行比对分析，发现长期处在压力下会导致小鼠肠道厌氧微生物的增多，同时使微生物丰富度及多样性降低。其中，紫单胞菌科（Porphyromonadaceae），特别是福赛斯坦纳菌属（Tannerella）的细菌相对丰度会降低。以鼠类柠檬酸杆菌（Citrobacter rodentium）感染小鼠，研究结果显示，长期处在压力下的小鼠比正常处理的小鼠更易于鼠类柠檬酸杆菌的定植。

与高通量测序技术在肠道菌群多样性研究中的应用相关的文章列表如下：

注：1、文章从四个方面进行了分类；

2、按2010年影响因子高低排列；

3、以下文章均采用Roche 454测序平台。

一、饮食、能量摄取、肥胖与肠道菌群之间的关系：

1. A core gut microbiome in obese and lean twins--2009《Nature》--if 36.10

2. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest --2006《Nature》--if 36.10

3. Functional metagenomics to mine the human gut microbiome for dietary fiber catabolic enzymes--2010《Genome Res》--if 13.58

4. High-fat diet determines the composition of the murine gut microbiome independently of obesity--2009《Gastroenterology》--if 12.03

5. Composition and energy harvesting capacity of the gut microbiota: relationship to diet, obesity and time in mouse models--2010《Gut》--if 10.61

6. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa--2010《PNAS》--if 9.770

7. Human gut microbiota in obesity and after gastric bypass--2009《PNAS》--if 9.770

8. Interactions between gut microbiota, host genetics and diet relevant to development of metabolic syndromes in mice--2010《ISME J》--if 6.152

9. Use of pyrosequencing and DNA barcodes to monitor variations in Firmicutes and Bacteroidetes communities in the gut microbiota of obese humans--2008《BMC Genomics》--if 4.205

10. Responses of gut microbiota to diet composition and weight loss in lean and obese mice--2011《Obesity》--if 3.530

11. The effect of diet on the human gut microbiome: A metagenomic analysis in humanized gnotobiotic mice--2009《Sci Transl Med》--if 3.510

12. Energy-balance studies reveal associations between gut microbes, caloric load, and nutrient absorption in humans--2011《Am J Clinc Nutr》

二、肠道菌群与疾病发生之间的关联

1. Microbes and Health Sackler Colloquium: Human oral, gut, and plaque microbiota in patients with atherosclerosis--2010《PNAS》--if 9.770

2. The macaque gut microbiome in health, lentiviral infection, and chronic enterocolitis  -- 2008《PLoS Pathog》--if 9.079

3. Culture-independent identification of gut bacteria correlated with the onset of diabetes in a rat model--2009《ISME J》--if 6.152

4. Redefining the role of intestinal microbes in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis--2010《Pediatrics》--if 5.390

5. Towards the human colorectal cancer microbiome--2011《PLoS One》--if 4.410

6. Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults--2010《PLoS One》--if 4.410

7. Structural shifts of gut microbiota as surrogate endpoints for monitoring host health changes induced by carcinogen exposure--2010《FEMS Microbiol Ecol》--if 3.456

三、抗生素治疗对肠道菌群的影响

1. Vancomycin-resistant Enterococcus domination of intestinal microbiota is enabled by antibiotic treatment in mice and precedes bloodstream invasion in humans--2010《J Clin Invest》 if 14.15

2. Reshaping the gut microbiome with bacterial transplantation and antibiotic intake--2010《Genome Res》--if 13.58

3. The pervasive effects of an antibiotic on the human gut microbiota, as revealed by deep 16S rRNA sequencing--2008《PLoS Biol》--if 12.46

4. Short-term antibiotic treatment has differing long-term impacts on the human throat and gut microbiome--2010《PLoS One》--if 4.410

5. Reproducible community dynamics of the gastrointestinal microbiota following antibiotic perturbation--2009《IAI》--if 4.098

6. Metagenomic analyses reveal antibiotic-induced temporal and spatial changes in intestinal microbiota with associated alterations in immune cell homeostasis--2010《Mucosal Immunol》--if 3.627

四、不同个体肠道微生物群落结构及其受其他外界因素（压力、致病菌感染、手术）的影响

1. Association between composition of the human gastrointestinal microbiome and development of fatty liver with choline deficiency--2010《Gastroenterology》--if 12.03

2. Depletion of luminal iron alters the gut microbiota and prevents Crohn's disease-like ileitis--2010《Gut》--if 10.61

3. Composition, variability, and temporal stability of the intestinal microbiota of the elderly--2011《PNAS》--if 9.770

4. Individuality in gut microbiota composition is a complex polygenic trait shaped by multiple environmental and host genetic factors--2010《PNAS》--if 9.770

5. Organismal, genetic, and transcriptional variation in the deeply sequenced gut microbiomes of identical twins--2010《PNAS》--if 9.770

6. Characterizing a model human gut microbiota composed of members of its two dominant bacterial phyla--2009《PNAS》--if 9.770

7. Comparative analysis of human gut microbiota by barcoded pyrosequencing--2008《PLoS One》--if 4.410

8. Community-wide response of gut microbiota to enteropathogenic Citrobacter rodentium infection revealed by deep sequencing--2009《IAI》--if 4.098

9. Stressor exposure disrupts commensal microbial populations in the intestines and leads to increased colonization by Citrobacter rodentium--2010《IAI》--if 4.098

10. Intestinal microbial ecology in premature infants assessed with non-culture-based techniques--2010《J Pediatr》--if 4.041

11. Sampling and pyrosequencing methods for characterizing bacterial communities in the human gut using 16S sequence tags--2010《BMC Microbiol》--if 2.960

12. Quantitative assessment of the human gut microbiome using multitag pyrosequencing--2010《Chem Biodivers》--if 1.585