再生医学研究：细胞来源识别系统
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一、前言
多细胞生物能够维持机体的动态平衡（Homeostasis），器官的功能单位--上皮细胞和周围间质细胞间的相互作用对于维持动态平衡起了重要作用。在一些生理过程中，尤其在发育，细胞的增殖分化、肿瘤的浸润转移和创伤治愈过程中组织基因的表达调节，都是由细胞周围的组织微环境进行调节的。进行再生医疗时，分化的胚胎干细胞（ES细胞）、诱导性多功能干细胞（iPS细胞）和骨髓间充质干细胞等形成器官，再移植到生物体内后，移植的细胞需要作为生物体内稳定的器官存在。同时，要确认移植组织能否存活并发挥作用、其余的宿主组织是否能利用移植组织的组织微环境进行再生。为此，需要从组织学上详细分析从干细胞分化诱导的细胞以怎样的状态存活在生物体内。
研究证实发育初期器官原基的上皮细胞的分化需要依赖周围环绕的间充质，从而改变组织微环境就可改变上皮细胞的预定发育[1]。由于需要识别已分化诱导细胞的来源，因此确立了以小鼠系统特异性抗原作为遗传标记物使用的细胞来源识别法，对已分化诱导的上皮细胞的来源进行识别。在嵌合子小鼠上使用这个分析方法，分析以组织干细胞为中心的细胞增殖单位[2]，或进行突变体小鼠和正常小鼠在嵌合子小鼠里基因表达的表观遗传学研究。在本文中，作者主要介绍运用CSA抗体开发出来的细胞来源识别法用以研究拥有这个遗传标记物的同族鼠系统。
二、使用实验小鼠的系统特异性遗传标记物进行干细胞研究
为了维持器官生理学及形态学上的动态平衡，以干细胞为中心的细胞增殖单位组成的细胞再生系统非常重要。干细胞可以不对称分裂，能够维持组织里供养新细胞的组织的特异形态和功能。这时，干细胞供给的所有细胞表达相同的遗传标记物，就可以明确干细胞谱系。Schmidt[12]及Ponder[13]的研究团队运用遗传独立的细胞构成的嵌合子小鼠的小肠，以系统不同表达有差异的双花扁豆凝集素（Dolichos Biflorus Agglutinin）反应性分子为标记物，分析小肠的嵌合体。结果显示，各种Crypto来自于每个干细胞底部。科研人员也正在研发导入β-半乳糖苷酶和GFP(green fluorescent protein)基因的转基因小鼠作为其他的细胞标记物。然而导入的基因可能不能稳定表达，有细胞内蛋白的表达也可使GFP的荧光和半乳糖苷酶酶活性消失。为解决上述问题，有时需要使用β-半乳糖苷酶抗体和GFP抗体，对转基因小鼠进行免疫组化分析。
表1. 细胞识别标记物标准
1.目标分子局限于细胞内，不能分泌。
2.细胞具有自主性，不会转移及影响周围的细胞。
3.最初表达的细胞在增殖后，该标记物在所有细胞都可以稳定表达。
4.发育过程中，在所有细胞中都表达。
5.在组织水平上，很容易能被检测到。
6.在小鼠系统间存在遗传性突变体。
7.表达不影响细胞分化和细胞杂交。
科研人员研发了可满足表1标准的抗CSA抗体的细胞来源识别法[1,2]。CSA（C3H Specific Antigen、如今的Hspa9基因）是在C3H系统小鼠里表达的小鼠系统特异性抗原[14,15]。在近交系小鼠里有两个基因突变存在。研究表明抗原存在于线粒体中（图1），基因存在于基因组内，并在所有细胞里表达。目前使用CSA抗体进行了以下研究：首先，在胎鼠颌下腺间充质里预定分化为下垂体原基上皮，通过诱导，使胎鼠颌下腺间充质转而分化成颚下腺腺样组织，证明分化的细胞确实来源于下垂体[1]。其次，分析使用了嵌合子小鼠的细胞系及细胞增殖单位[2]，再根据组织干细胞了解增殖模式。成熟的每个Crypto都从单一的干细胞得到细胞供给，从而维持组织形态。最后，从各种突变小鼠和正常小鼠之前的嵌合体的分析中，证实了基因表达里存在细胞自主型和微环境依赖型[3-11]。如图2所示，神经异常的摇晃小鼠（reeler mouse）←→正常小鼠嵌合体的小脑可形成正常形态，行动也正常化。在此使用抗CSA抗体，分析小脑的嵌合体，显示从摇晃小鼠（reeler mouse）而来的浦肯野细胞也在少数正常神经胶质细胞的支持下形成正常小脑层结构。最后，在癌症、克隆分析研究[16-22]或再生医学研究中，移植的小鼠新生肝细胞能在宿主肝脏上生存[23-25]。
图1，抗CSA抗体的细胞免疫染色图
用抗Complex II抗体（左下图）和抗CSA抗体（左上图）进行双重染色，显示CSA分子局部存在于细胞内的线粒体中。同时，嵌合子小鼠成纤维细胞的原代培养里混合了两个系统的细胞（右图）。
图2、免疫染色摇晃小鼠（reeler mouse）（阳性）←→BALA/cA（阴性）嵌合小鼠，分析细胞组成
使用抗IP3受体抗体和抗CSA抗体免疫染色摇晃小鼠（reeler mouse）（阳性）←→正常小鼠的嵌合小脑的临接切片。小脑层结构正常形成。摇晃小鼠而来的CSA阳性细胞（长箭头指向）和正常组织而来的阴性细胞（短箭头指向）。（本图片转自参考文献9）
三、未来再生医学的目标
把ES细胞、iPS细胞和骨髓间质干细胞等干细胞应用于临床，需要详细地监测移植细胞在生物体内的动态。同时，还要从组织学上明确地证明移植的组织不能仅于一段时间内生存，还需要能够长期地在生物体内存活并持续发挥作用。
四、本系统的应用领域
本系统可应用于表2的以下领域，可用于与细胞分化有关的发育生物学、肿瘤和再生医疗在个体水平上的等研究系统。
表2.本系统的应用领域
| 研究领域 | 用途 | 研究 |
| 再生医疗 | 在再生医疗基础研究方面，能观察移植细胞的组织结构和分类细胞来源。 |
◆对骨髓未分化间充质干细胞的各种细胞的分化研究 ◆神经干细胞的移植研究的分析 ◆未分化胚胎干细胞的分化诱导研究 |
| 发育生物学 | 在细胞系谱研究方面，能进行分类细胞来源。 |
◆使用嵌合体小鼠的基因功能表达评价法 ◆组织、器官形成及细胞再生的研究 |
| 肿瘤研究 | 在肿瘤的浸润、转移方面，能分析肿瘤组织和正常组织间的相互作用。 |
◆研究肿瘤细胞的相互作用 ◆肿瘤组织的克隆研究 ◆肿瘤干细胞的研究 |
五、本系统的构成
这种细胞来源识别系统、识别抗体、ES细胞以及各同族鼠种，能自由组合进行各种研究。以下是各要素简单的说明。
1. 小鼠单抗（抗CSA抗体）
本抗体可用于ES细胞、iPS细胞和骨髓间质干细胞等再生医疗研究方面的基础性研究，能识别在宿主组织内由移植细胞而来的全部细胞。本抗体的抗原是在小鼠系统的所有组织里长期表达的热休克蛋白（Hspa9），在细胞分化和癌化方面，表达不会消失。而且无需进行昂贵的基因重组实验，能在组织学水平上得到稳定的分析结果。
2. 从表达阳性变异的系统而来的胚胎干细胞
干细胞来源于从抗体表达阳性变异的近交系小鼠系统建立的ES细胞株，ES细胞可分化成生殖细胞再形成个体。另外，因为这个细胞株是基于遗传性近交系的基础上建立的，所以具有均一的遗传背景。
3. BALB/cA-CSA同族鼠和C57BL/6N-CSA 同族鼠
未来的再生移植医学，针对个体水平进行研究是十分重要的。为此，需要使用遗传背景均一的近交系小鼠进行研究。BALB/cA-CSA （或者是C57BL/6N-CSA）同族鼠系统是回交确认上述抗体的C3H型突变基因，从而导入建立的同族系统。这种小鼠繁殖率高，与母系统BALB/cA（或者是C57BL/6N）系统之间无需特殊处理就可相互移植组织及细胞。同时，BALB/cA-CSA同族系统里导入裸基因，建立BALB/cA-CSA.nu双重同族鼠，能应用于研究人类细胞的移植和细胞间相互作用。
4. C3H/HeN-BaCSA同族鼠
这个系统是回交抗体阳性系统C3H系统上的BALB/cA的CSA变异基因再导入的小鼠系统。对这个小鼠移植C3H而来的ES细胞时，因为是同系同族鼠，移植细胞不会产生免疫排斥，能在生物体内长期存活。
六、结语
本文中，作者介绍了可长期进行细胞间相互作用研究的工具“细胞来源识别系统”。如今对于GFP表达细胞、GFP转基因小鼠的研究很多，如上所述，在今后的再生医学上，把ES细胞、iPS细胞和骨髓间质干细胞等干细胞应用于临床应用，需要详尽地把握移植细胞在生物体内的动态。同时，还要从组织学上明确地证明移植的组织不能仅于一段时间内生存，还需要能够长期地在生物体内存活并持续发挥作用。在这个目标下，期待本识别法可在同族鼠等领域里广泛使用。
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