使用抗Argonaute抗体进行microRNA研究的方法介绍

前言

近年来，microRNA(miRNA)成为生命科学和医学领域的明星。人类和小鼠含有1000多种microRNA，虽然只有22个左右的碱基，但是在基因表达调控中起着至关重要的作用，参与细胞分化、个体发育，且与多种疾病相关，因此对于miRNA的研究越来越多。

在细胞中，成熟的miRNA分子可与Argonaute(Ago)蛋白家族形成RNA沉默复合体(RISC)，降解靶mRNA或者抑制转录（图1）。在人类中普遍存在4种Ago蛋白（Ago1-Ago4），在Ago家族蛋白中表达最多的是Ago2，它具有Slicer活性，可切割其靶RNA，在microRNA调控路径中具有重要意义。针对这种Ago蛋白，利用抗体，经RISC免疫沉淀，即microRNA与靶mRNA共沉淀，由此可回收microRNA。

图1. microRNA的克隆和作用原理

本实验组用Argonaute蛋白抗体，纯化并克隆microRNA和靶mRNA（图2）。使用该技术，可综合分析存在于细胞、组织等RISC中的microRNA和mRNA。以下将简单介绍各种技术的使用方法、分析实例。

图2.  免疫沉淀法的microRNA分析

microRNA纯化技术

本实验组利用抗Ago抗体免疫沉淀法进行microRNA的纯化。科研人员使用针对人类/小鼠Ago1、人类Ago2、小鼠Ago2以及人类Ago3的抗体进行免疫沉淀，人类Ago4的实验还在摸索中。使用该技术可从细胞、组织样品中纯化到结合了各种内源性Ago蛋白的microRNA（图3）。

图3.  来源于人类培养细胞株的microRNA纯化
使用人Ago2抗体将由3种培养人细胞株(HeLa、HepG2、HEK293)以及小鼠细胞株(P388D1)纯化的RNA片段Urea-PAGE后，通过银染检测，其结果表明可从人类培养细胞特异性纯化microRNA。使用细胞数为5×10⁶个。

microRNA和mRNA的结合区最短为6个碱基，经电脑分析，仅据碱基互补配对得到的mRNA有很多，靶mRNA鉴定困难。但是使用本技术，可通过反应生成的各Ago蛋白的复合体，形成mRNA和microRNA的共沉淀。通过研究获得的免疫沉淀物中microRNA和mRNA的相互变化，配合电脑分析，可高效鉴定mRNA。

microRNA克隆

获得的microRNA一般利用微阵列、定量PCR、克隆等方法进行分析，克隆法具有可以鉴定新分子的优点。本研究组使用纯化得到的miRNA进行克隆，研究发现rRNA和tRNA等分解产物或人工序列污染较少，得到的高效microRNA克隆（图4）。然后通过测序分析，有利于新microRNA的发现。

图4. Ago免疫沉淀后，进行small RNA的克隆，可得到microRNA高效克隆子

目标靶mRNA克隆

利用微阵列、定量PCR等方法可分析Ago免疫沉淀RNA中含有的mRNA。为了进一步研究，本实验组通过采用随机引物（RandomPrimer）合成互补链cDNA，将来源于Ago免疫沉淀物中mRNA的cDNA经该方法合成放大，进行毛细管电泳（图5）。本方法的优势在于可扩增通过芯片不能鉴定的cDNA，包括RISC内mRNA以外的RNA分子。

图5.进行Ago2免疫沉淀mRNA的克隆
 用抗人Ago2单克隆抗体（免疫动物：小鼠）以及小鼠IgG，从HaLa细胞中免疫沉淀纯化RNA片段，进行cDNA合成、PCR扩增，利用毛细管电泳检测片段。结果显示，用抗Ago2抗体，可从免疫沉淀片段中特异性检测到来源于mRNA的cDNA片段。

本实验组已经使用本技术研究特定microRNA的靶mRNA。有报告指出，miR-122与肝细胞癌化有关，伴随着细胞癌化，具有肝脏特异性的miR-122，其表达量会降低。科研人员向几乎没有miR-122表达的人肝癌细胞株HepG2中导入miR-122，克隆Ago2免疫沉淀物中mRNA的cDNA，将其表达谱与导入虫荧光酶siRNA的对照细胞作比较，得到的克隆子经TargetScan分析，显示大量存在准确率高的克隆子。对这个克隆子进行定量PCR分析，向多种物质中导入miR-122，mRNA与Ago2形成免疫沉淀物，mRNA作为总量（图6）。其中存在没有报道的目标克隆子，这些可以作为miR-122新候补靶mRNA。

图6. miR-122的靶mRNA探索
 miR-122导入细胞在Ago2 免疫沉淀RNA（Ago2 IP RNA）中特异性浓缩，存在高克隆效率。反而，Total RNA经RISC分解，其存在的克隆子比对照细胞少。其中，这些序列（SLC1A5、PIGG、SLC7A5）可以作为没有报道的miR-122新候补靶序列。

结语

综上所述，利用microRNA、靶mRNA与Ago蛋白形成沉淀复合物，克隆出microRNA和靶mRNA，可以综合分析含有RISC的microRNA和mRNA。这种方法可应用于新microRNA的鉴定、microRNA的表达谱分析、靶mRNA的研究等microRNA功能分析，有望应用于医药行业、减少siRNA脱靶效应（off-target）等。用于纯化技术的抗Ago蛋白抗体除了用于免疫沉淀，还可用于免疫印迹和细胞染色等。